食品微生物检验方法.doc

食品微生物检验方法(FDA与ISO对比)
内容提要:
?菌落总数检测
?大肠菌群及大肠杆菌检测
?金黄色葡萄球菌检测
?沙门氏菌检测
?单核细胞增生李斯特氏菌检测
菌落总数测定——菌落总数的概念
?菌落总数是指在被检样品的单位重量(g)、容积(ml)或表面积(cm2)内,所含能于某种固体培养基上,在一定条件下培养后所生成的菌落的总数。
菌落总数测定——卫生学意义
?判定食品被细菌污染的程度及卫生质量。
?及时反映食品加工过程是否符合卫生要求,为被检食品卫生学评价提供依据。
?通常认为,食品中细菌数量越多,则可考虑致病菌污染的可能性越大,菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。
FDA BAM 菌落总数测定流程
检样xg/mL+9xml稀释液(磷酸盐缓冲液)
适当十倍稀释样品
选择2~3个连续适宜稀释度
各取1mL分别加入灭菌平皿内
(每个稀释度做两个平行)
每皿内加入适量平板计数琼脂(PCA)
35 ℃ 48 ± 2h
菌落计数
FDA BAM 菌落计数方法
?选择25~250CFU之间的菌落进行计数,计算公式如下: N=∑C/(1*n1+0.1*n2)*d
?所有平板的菌落数都不足25CFU,报告EAPC/ml(g)为<25*1/d。 EAPC:estimated aerobic plate count
?所有平板的菌落数都超过250CFU,但不足100/cm2 ,报告EAPC/ml(g)为最接近250CFU的平板菌落数的估计值,乘以相应的稀释度。
?所有平板的菌落数都超过100/cm2 ,计算平板的面积(直径为90mm的平板面积为65cm2),估计最高稀释度每cm2的菌落数,乘以相应平板面积作为该稀释度的菌落计数结果,报告EAPC/ml(g)为>65*100* 1/d。
?无法计数的平板报告LA(Laboratory Accident)。
?最终结果保留前两位有效数字。按照4舍6入,5是奇进偶不进。
ISO4833-2003 菌落总数测定流程
检样xg/mL+9xml稀释液(磷酸盐缓冲液)
适当十倍稀释样品
选择2~3个连续适宜稀释度
各取1mL分别加入灭菌平皿内
(每个稀释度做两个平行)
每皿内加入适量(12~15mL)
平板计数琼脂(PCA),
30±1 ℃ ,72 ±3 h
菌落计数
ISO4833-2003菌落计数方法
?选择连续2个稀释度不超过300CFU的平板,且一个平板至少含15CFU进行计数,计算公式如下: N=∑C/(n1+0.1*n2)*d
?所有平板的菌落数都不足15CFU,计算2平板菌落的算术平均值m,液体样品:NE=m 固体样品: NE=m×d-1
?无菌生长:液体样品:less than 1; 固体样品:less than 1 ×d-1
?最终结果保留前两位有效数字。
菌落总数测定几点说明
?由于检样中采用30/35℃有氧条件下培养,因而并不是样品中实际的总活菌数,一些特殊营养要求的细菌、厌氧菌、微需氧菌、以及非嗜中温细菌,均难以反映出来。
?鉴于食品检样中的细菌细胞是以单个、成双、链状、葡萄状或成堆的形式存在,因而在平板上出现的菌落可以来源于细胞块,也可以来源于单个细胞,因而平板上所得菌落的数字不应报告活菌数,而应以单位重量、容积或表面积内的菌落数或菌落形成单位(colony forming units,CFU)报告。
菌落总数测定几点要求
?每个样品从开始稀释到倾注最后一个平皿所用的时间不得超过15min,主要为防止细菌增殖和产生片状菌落。样液与琼脂应充分混合,避免将混合物溅到平皿壁和皿盖上。皿内琼脂凝固后,不要长时间放置,然后倒置培养,可避免菌落蔓延生长。
?检样过程中应用稀释剂做空白对照,用以判定稀释液、培养基、平皿或吸管可能存在的污染。同时,检样过程中应在工作台上打开一块空白平板计数琼脂,其暴露时间应与检样时间相当,以了解检样在检验操作过程中有无受到来自空气的污染。
?检样稀释液有时带有食品颗粒,为避免与细菌菌落发生混淆,可作一检样稀释液与平板计数琼脂混合的平皿,不经培养,于4 ℃放置,以便在计数检样时用作对照。
大肠菌群的定义
?大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。
?大肠菌群不是细菌学上的分类命名,而是根据卫生学方面的要求,提出的与粪便污染有关的细菌,即作为食品、水体等是否受过人畜粪便污染的指示菌,这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。根据进一步的生化试验,可将这群细菌再分为大肠艾希氏菌(俗称大肠杆菌)、弗氏柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。
大肠杆菌的定义
?大肠杆菌(也称大肠埃希氏菌),分类于肠杆菌科,归属于埃希氏菌属。
?大肠杆菌指革兰氏阴性无芽孢杆菌、乳糖发酵产酸产气、IMViC试验(靛基质、MR、V-P、柠檬酸盐试验)为++--或-+--的细菌。
?与人类有关的大肠杆菌统称为致泻性大肠杆菌,包括五种:肠毒素性大肠杆菌(ETEC)、致病性大肠杆菌(EPEC)、出血性大肠杆菌(EHEC)、侵袭性大肠杆菌(EIEC)、黏附性大肠杆菌(EAEC)。
卫生学意义
?大肠菌群和大肠杆菌是评价卫生质量的重要指标,作为食品中的粪便污染指标。
?食品中检出大肠菌群,表明该食品有粪便污染,既可能有肠道致病菌存在,因而也就有可能通过污染的食品引起肠道传染病的流行。大肠菌群数的高低,表明了粪便污染的程度,也反映了对人体健康危害性的大小。
?大肠杆菌在外界存活时间与一些主要肠道致病菌接近,它的出现预示着某些肠道病原菌的存在,因此该菌是国际上公认的卫生监测指示菌。近年来,有些国家在执行HACCP管理中,将大肠杆菌检测作为微生物污染状况的监测指标和HACCP实施效果的评估指标。
大肠杆菌的生物学特性
基本形态:
此菌为两端钝圆的短小杆菌,一般约0.5-0.8μm*1.0-3.0 μm,多单独存在或成双,但不呈长链排列。约50%的菌株有周生鞭毛,但多数只有1-4根,一般不超过10根,故菌体动力弱。多数菌株有菌毛,有的有荚膜或微荚膜,不形成芽孢,对普通碱性染料着色良好,革兰氏染色阴性。
培养特性:
?大肠杆菌合成代谢能力强,在含无机盐、铵盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。最适生长温度为37℃,在42-44 ℃条件下仍能生长,生长温度范围15-46 ℃。
大肠菌群及大肠杆菌测定
——MPN法检验流程(FDA BAM)
检样50g+450ml稀释液
适当十倍稀释样品
选择3个适宜的连续稀释度的样品稀释液,
每个稀释度接种三管LST肉汤(每管9mlLST肉汤并加有导管),
每管接种1mL
35℃ ,24 ± 2h ~48 ± 2h
没有产气管 有产气管
报告阴性
接种BGLB肉汤管 接种EC肉汤
44.5±0.5 ℃ (水浴培养)