大肠杆菌高效表达重组蛋白策略.pdf

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中国生物工程杂志 China Biotechnology,2007,27(9):103~109
大肠杆菌高效表达重组蛋白策略
任增亮2堵国成2。陈坚2吴教2
(1食品科学与技术国家重点实验室江南大学无锡2141222江南大学生物工程学院无锡214122
(3江南大学工业生物技术教育部重点实验室无锡214122)
摘要大肠杆茵表达系统是基因表达技术中发展最早和目前应用最广的经典表达系统。利用该
系统表达重组蛋白具有许多优越性,但其表达效率受诸多因素的影响。综述了国内外利用大肠
杆菌表达系统高效表达外源蛋白的策略,主要包括选择合适的启动子、改变信号肽结构、提高
mRNA稳定性、提高翻译效率、表达稀有密码子、降低包涵体形成及蛋白降解,利用融合蛋白与分
子伴侣、调控发酵条件实现高密度培养等。
关键词大肠杄茵基因工程重组蛋白克隆表达
中图分类号Q786
表达重组蛋白受许多因素的影响,如菌体生长特过量表达外源蛋白尤其是对细胞有毒性的蛋白会严重
性,基因转录水平,产物到达部位,翻译后修饰过程以抑制菌体生长而使蛋白总表达量下降;(3)启动子的诱
及蛋白的修复调控等。虽然一些含复杂二硫键结构导要求简便而廉价。现在比较常用的是温度诱导和
或者来源真核生物需要翻译后修饰的蛋白,不能利用IPTG诱导”(表1)。IPTC诱导主要应用于基础性研
E.co系统?得到高效表达而选择植物细胞、哺乳动物究,由于其毒性和价格昂贵而不能用来生产人类药用
细胞组织“和其它微生物宿主,但是大肠杆菌具有遗蛋白,所以限制了tac和re启动子的广泛应用。温控
传背景清楚、繁殖快、成本低、表达量高、表达产物容易型诱导方式简单而且廉价,另外也有改造的启动子如
纯化、稳定性好、抗污染能力强以及适用范围广等优突变的Ilac启动子,利用温度或IPTG都可以诱导。
点,是基因表达技术中发展最早和目前应用最广泛
SD序列在起始序列上游5~13bp处,可以消除
的经典表达系统?,迄今已有大量有关该系统高效表mRNA的电势而提高转录效率。RBS的3'和5'端都富
达重组蛋白的研究?。
含嘌呤碱基?。抗生素标记主要用来筛选重组子和提
1表达载体的构建
供选择压,氨苄青霉素抗性标记最常用,但是在生产人
类药用蛋白时要考虑其它抗性标记,防止用药过程中
表达载体的构建是实现高效表达的关键步骤。
出现对青霉素的过敏反应?。表达载体拷贝数决定于
个完整表达载体包含必需的几ル个元件(图1)。启动子复制起点;使用强启动子和高拷贝质粒会降低宿主细
位于转录起始位点上游-10bp~35bp,受载体自身或胞的存活力而最终不一定能提高目的蛋白的产量。
宿主染色体相应的调节基因调控。一个理想的启动子Kim等?在目的基因上游使用双启动子,有效提高了
需要具备如下特点:(1)具有强启动性,使重组蛋白达表达量。
到菌体表达蛋白总量的10%~30%;(2)必须受调节基
因严谨调控。在一定菌体浓度下开始诱导表达,否则
收稿日期:2007-07-19修回日期:2007-08-2
*教育部新世纪人才计划资助项目(吴敬),江苏省自然科学基金
资助项目(BK2007019)
本*通讯作者,电子信箱: Jingwu@ jiangnan.edu,cn
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中国生物工程杂志 China Biotechnology
Vol.27No.92007
RBS
R
35-0
coling sequence
STOP coion
YAA[
TTGACA(N) IITATAAT
IGA
START codon
UAG
l6rRNA3” Ho Afluccuc e
UUG(1%)
图1原核表达载体的主要元件组成简图
箭头所指为转录方向。在核糖体结合位点(RBS)中有SD序列,富含嘌呤,该序列与核糖体16 S RRNA的3端互补配对,促使核糖体结合
到mRNA上,有利于翻译的起始。RBS的结合强度取决于SD序列的结构及其与起始密码AUG之间的距离,SD与AUG之间相距一般以
4-~10个核苷酸为佳。阻抑物由调节基因编码,调节基因位于载体或者整合在染色体上。转录终止子(T)保持mRNA的稳定性。复制
起点Om决定质粒拷贝数
Fig. I Schematic presentation of the salient features and sequence elements of a prokaryotic expression vector
表1E.col常用启动子及特点
Table 1 Promoters used for the high-level expression of genes in B. coli
Promoter
Regulation
Induction
Problems
lac (lacuv5)
laci, Lac/
IPTG. thermal
Low-level expression relative to other systems; leaky expression
Trp starvation 1AA
Leaky expression
tac
lacl, lac?
IPTG. thermal
Leaky expression
入P
A入cts857
ot be performed at low
partial induction cannot be achieved
laci, lac/
IPTIG. thermal
Leaky expression; difficult to achieve high cell densities
)B, phor
hosphate starvation
Not titratable; limited media options
ara
Lー Arabinose
Few vectors available; catabolite repressed by glucose
Limited characterization few vectors available
CA
lexa
Walid
id
Not titratable
2信号肽的结构对分泌功能的影响
酶识别
现在有大量信号肽可供选择,如来自E.coli的
重组蛋白向大肠杆菌的周质空间和胞外分泌都需ompA,phoA,ompF,ompT,lanB;来自金黄色葡萄球菌的
要一段大约15~30个氨基酸的信号肽引导蛋白质的A蛋白;来自胡萝卜软腐欧文氏菌的pelB以及人类生
转运。研究发现典型的信号肽序列N-端一般含有2~长激素的信号肽等。将人类β-内啡肽基因和一种外膜
10个带正电荷的氨基酸残基,C-端有10~20个疏水的蛋白ompF融合后能促使其分泌到培养基中!。使用
氨基酸残基。信号肽N-端的正电荷对蛋白质穿膜的效木聚糖酶信号肽,2种不同杆菌的碱性磷酸酯酶被分泌
率有重要影响。信号肽富含疏水氨基酸残基,如丙氨到大肠杆菌的周质空间。同样,使用这个信号肽后,人
酸、缬氨酸和亮氨酸,这是蛋白分泌到大肠杆菌周质空的粒细胞集落刺激因子也被分泌到周质空间。合适