应用PCR-FINS技术鉴定金枪鱼罐头中金枪鱼种类.pdf

分舐与捡测
DO:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.20160602
应用PCR-FINS技术鉴定金枪鱼罐头中金枪鱼种类
安丽艳,孟镇,仇凯2“,钟其顶2,杨形晖2,郭新光'2
1(中国食品发酵工业研究院,北京,100015)2(全国食品发酵标准化中心,北京,100015
摘要为考察金枪鱼罐头中DNA降解程度以及鉴定金枪鱼罐头中金枪鱼种类,文中根提鱼类线粒体基因组
( m TDNA)细胞色素b(cyxb)基因和12 S TDNA基因,利用3对通用引物分別扩增片段大小为358bp(cytb)、224
bp(12 S RDNA)、123bp(eytb)的目的片段,同时,基于123bp线粒体cytb基因片段,通过法医信息核苷陵刘序
(PCR-FINS)技术来鉴别金枪鱼罐头中金枪鱼的种类,并对17个市僖金枪鱼罐头样品进行金枪鱼种类鉴定。结
果表明:金枪鱼罐头中DNA降解严重,其片授大小在100~200bp;该研究建立的PCR-INS技木,可以实现金枪
色罐头中金枪鱼种类的准确鉴别:17.个市售金抢鱼罐头样晶中,58,8%来源于价格低廰的鏗鱼,其次还包括长鳍
金枪鱼、青干金枪鱼、扁鮀鲣、鱼
关键词PCR-FINS;金枪鱼罐头;种类鉴定
金枪鱼类是硬骨鱼纲、辐鳍亚纲、鲈形目、鲭科中片作为阳性对照
金枪鱼属、狐鲣属、舵鲣属、鲣属和鲔属的统称,多达171,2主要试剂
个金枪鱼品种。金枪鱼罐头因其营养美味、食用方
CTAR裂解液[4%CTAB,100mmol/ L Tnis-HC]
便、货架期长、便于携带等特点,深受广大消费者的喜(pH8.0),1.4mol/ L NAGI,20mmol/ L EDTA(pH
爱21。然而,金枪鱼罐头市场鱼目混杂,标示不清
8.0)];TE缓冲液(0.01mol/ L Tris,0.001mol/LED
市面上所销售的金枪鱼罐头,大多仅标示为金枪鱼罐。TA,pH8.0); Tag DNA聚合酶、 DNTPS、100 bp Mark
头,未标注所用原料的具体种属信息。
er,均购自北京全式金生物技术有限公司;琼脂糖、三
水产加工品的原料品种鉴别已成为水产加工行氯甲烷/异戊醇体积比241、无水乙醇、异丙醇
业中面临的重要问题之一。2003年,欧盟建立了鱼1.3主要仪器
类及其制品标签法,明确规定鱼类制品必须贴有标明
冷冻离心机,美国 Sigma公司; T gradient PC
商业名称、生产方法和捕获区域的标签。美国食増仪,德国 Biometra公司;DYY8C.型高压电泳仪,北
品药品管理局(FDA)列出一个可食水产品名单,规京六一仪器厂:CV1000型凝胶成像系统,法国
定水产品标示必须使用该名单中规定的名称。我 YBER LOURMAT公司;压力蒸汽灭菌锅(LS
国国家标准GB77182011食品安全国家标准预包B5OL),上海医用核子仪器厂。
装食品标签通则》也明确要求,食品名称应清晰的反1.4实验方法
映食品的真实属性
1.4.1DNA提取
目前,国内对鱼类罐头鱼源性成分鉴别尚无相关
取100mg金枪鱼罐头肌肉组织样品于2mL离
报道。本研究采用PCR-FINS方法对金枪鱼罐头食心管中,加人1mLV以(三氯甲烷):(甲醇):W(水)=
品鱼源性成分进行鉴定,旨在建立高效、便捷的金枪1:2:0.8,室温静置过夜,500rmin离心3min,弃
鱼鑪头中金枪鱼种类的PCR-FINS鉴定方法
上清液,无菌去离子水清洗样品,样品组织于-40℃
保存刑。
1材料和方法
参考 UNSEI.D”的研究,并进行适当修改。取上
1.1实验材料
述组织样品,加入1 ML CTAB提取液[4%CTAB,100
金枪鱼罐头,购自当地的超市。黄鳍金枪鱼生色mmol/ L fris-fHC!(pH8.0),1.4mol/ L Naci,20
mol/ L EDTA(pH8.0)],65℃温育1~2h,期问每
第一作者;硕土研究生(仇凯为通讯作者)
收稿円期:2315-10-16,改国H期:2015-]2-07
隔15min颠倒混匀1次。温育后,离心取上清液,
等体积的(三氯甲烷):(异成醇)=24:1抽提2
2016年42卷第6期(总鬼342期)159
万方数据
食品与发酵工业「FO0 AND FERMENTATON NDUSTRIES
次。加2/3体积预冷的异丙醇沉淀DNA,-20℃,
PCR扩增体系为25uL:10 x PCR buffer(Mg3')
1h。离心弃上清液,沉淀用体积分数70%预冷的2.5uL,dNTP(2.5mmol/L)2pL,20pmol/uL引物各
乙醇洗涤2次,干燥。沉淀用100uLTE(0.01mol/1uL,模板DNA2pL, Taq DNA Polymerase0.3pL
LTis,0.001mol/ L EDTA,pH8.0)缓冲液溶解,冰(1.5U),dH2016.2uL。PCR扩增条件为:94℃预
冻保存。
变性3008,94℃变性305,相应退火305,72℃延伸
4.2基因扩增
30s,35个循环,最后在72℃延伸300s。PCR扩增
为了考察金枪鱼罐头中DNA降解程度,以7种不产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测。
同加工工艺的金枪鱼罐头为研究对象,1.4.1提取的线1.4.3市售样品基因扩增
粒体基因组DNA为模板,参考文献”?,根据鱼类线
将市面上采集的17个金枪鱼罐头样品的线粒体
粒体基因组( mt DNA)eytb基因和12 Sr DNA基因,选基因组DNA利用通用引物59-3/59-5进行PCR
取3对通用引物(见表1)进行PCR反应。
扩增,扩增产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测并送往
华大测序公司测序。
表1通用引物序列及扩增产物大小
1.4.4数据处理
Table I The sequences and products size of
运用NCBI的 BLAST程序,把所有样品的PCR
universal primers
引物
产物测序结果与 Genebank数据库中已有金枪鱼线粒
区城名称
引物序列
片段退火温
(S-3')
大小度/℃
体gytb基因序列进行比较。
MTDNA
CACAATC ATATTTGTCCTC
结果与分析
123bp50
GCTCGTACCTCTA
CAAAGAAACATGAAACA
2.1金枪鱼罐头DNA降解程度
TAAGAGGGCCGGTA
MTDNA 12s
由于金枪鱼罐头在加工过程中需经过高温高压
AAACTC
12SRDNA
处理,根据相关文献报道"0-,DNA片段降解严重,
12S-R GTGGGGTATCTAATCCCAG
CCATCCAACATCTCAGCAT-
为了考察金枪鱼罐头中DNA降解程度,同时保证获
Cyl BL
GATGAAA
358bp50
取足够数量和质量的DNA模板以适用于后续的分子
cyt b
CCCCTCAGAATGATATTT
Cyt bh
生物学研究,使用表1中3对通用引物对提取的线粒
GTCCTCA
体基因组DNA进行PCR扩增,扩增产物的琼脂糖凝