流动注射化学发光法测定溶菌酶含量.pdf

第39卷
分析化学( FENXI HUAXUE)研究简报
第7期
年7月
Chinese Journal of Analytical Chemistry
1100~1103
いンい
DOI:10.374/SP.J.1096.2011,01100
研究简报
し令ととととっ
流动注射化学发光法測定溶菌酶含量
嵇正平王俊韩静胡效亚
扬州大学化学化工学院,食品化学研究所,扬州225002
摘要基于溶菌酶催化水解壳聚糖的产物氨基葡萄糖,与金溶胶-鲁米诺可产生很强的化学发光,建立了流
动注射化学发光测定溶菌酶含量的方法。对水解和化学发光反应条件进行了考察。结果表明-pH4.0、50℃
水解5h为最佳水解条件。在金胶、鲁米诺及NaOH的浓度分别为0.05,0.05和10 mmo/L条件下,化学发光检
测效果最好。在优化条件下,溶菌酶浓度在5~800ugL范围内与化学发光强度有良好的线性关系,方法的检
出限为4gL。本方法可用于蛋清中溶菌酶含量的检测。
关键词化学发光;溶菌酶;壳聚糖;鲁米诺
溶菌酶又称胞壁质酶或N乙酰胞壁质聚糖水解酶,广泛存在于植物、鸟类、哺乳动物、细菌等生物
体内及分泌物中。作为一种动物体内在的抗体,它可以通过溶解细菌尤其是革兰氏阳性菌的细胞壁,阻
止细菌的人侵。因此,溶菌酶常被用作肉类、奶酪、蔬蔾和新鲜水果等物品的防腐剂,也有一些文献报道
了其作为抗感染和溃疡药物的应用叫。溶菡酶的使用存在一些争议,因为有个案研究显示,溶菌酶会导
致过敏叫。所以,研究溶菌酶的检测方法很有意义。目前,检测溶菌酶的方法有免疫检测法、分光光度
法、HPLC法、质谱法?及荧光法等。
化学发光法具有简单、快速、灵敏度高、线性范围宽等优点,其中应用最广泛的是鲁米诺体系P。
Zhang等报道的纳米金属材料催化鲁米诺化学发光体系,可用于含氨基化合物的检测”。其化学发
光机理为:纳米金属材料催化溶解氧氧化含氨基的螯合剂生成H2O2,进而氧化鲁米诺产生化学发光。
此基础上,本研究利用溶菌酶催化水解壳聚糖,产生氨基葡萄糖,再被纳米金一鲁米诺化学发光体系所检
測,建立了溶菌酶的化学发光检测新方法。
2实验部分
2.1仪器与试剂
IFFM-E型流动注射化学发光仪(西安瑞迈分析仪器有限公司); tecnai12(120KV)透射电镜(飞利
浦公司);PHs-25型数显pH计(上海精密科学仪器有限公司)。
20mgL溶菌酶储备液:将20mg溶菌酶(二次结晶,活力2000mg)溶于水,定容至100omL
4℃冷藏备用;1%壳聚糖储备液:称取10.00g壳聚糖(1.5×10°kDa)溶于1000mL醋酸(1%)醋酸钠
(1%)缓冲液中;10mmo兀L鲁米诺(陕西师范大学)储备液;1%柠檬酸钠溶液;0.2 mmol/L氯金酸溶液;
0.1mol/ L NAOH;0.1 mol/L HCI,以上试剂为分析纯,本实验用水均为二次蒸馏水
2.2金胶的制备
采用文献[18的方法,将100mL氯金酸溶液加热至沸,在剧烈搅拌下迅速加入3.00mL柠檬酸钠浴
液,搅拌条件下回流15min,去掉热源继续搅拌10min,得粒径为19nm的纳米金胶。将制得的金胶冷
却至室温,放于冰箱(4℃)中备用。通过改变柠檬酸钠溶液的加入量,可以制得不同颗粒的金胶。
201011-25收稿;2011-03-15接受
本文系863计划专题项目(No.2009AA03Z331)资助
M E-mail: xyhua, yzu. edu. cn
第7期
嵇正平等:流动注射化学发光法测溶定菌酶含量
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2.3壳聚糖的水解
分别移取壳聚糖储备液2.00mL,再加入不同量溶菌酶溶液,用HC?I或NaOH调至pH=4.0,稀释至
50.00mL,50℃恒温水解5h得水解样。同时,制得不加溶蘭酶的样品空白。
2.4化学发光检测
流动注射发光装置如图1所示,样品空白C与水解样S通过换向阀交替进入管路,再与碱性鲁米诺溶
液R,(0.05 mmol/L鲁米诺+20moM/ L NAOHI混合,混合液在化学发光池与金溶胶R2(005 mmol/L)接触,化
学发光讯号被光电倍增管PMT检测。记录发光强度与时间的关系曲线,根据峰值高度计算溶菌酶含量
各管路流量均为2.0mL/min,流通管内径2mm。
样品空白
蠕动泵1
进样阀 Valve
水解样
废液
鲁米诺
Waste
光电倍增管
R
otomultiplier
金溶胶R
端动泵2Pump2
tube
Gold colloids
废液
W
图1流动注射化学发光检测示意图
Fig 1 Schematic diagram of CL flow system
结果与讨论
3.1水解条件
改变壳聚糖储备液的体积,并于不同的水解时间取样进行分析。结果表明,随着壳聚糖用量增加
水解时间的增长,被检出的化学发光增强。当壳聚1000
糖体积大于2mL、水解时间达5h,发光强度变化较
缓。过大的壳聚糖体积及过长的时间均导致基线的
噪音过大。本研究中壳聚糖体积选择为2mL、水解
时河为5h。
考察了pH值对水解速度的影响,结果如图2。
pH4.0时,水解产物被检发光强度最高且较稳定。
2000
检测了不同温度下,水解产物的发光强度
(图3),当温度低于50℃时,两者呈正相关性;温度
6.0
高于50℃,发光强度反而下降
图2pH值对水解反应的影响
综上所述,p40的00%克聚糖(加人储备微Fs2 Effect of PH on hydrolyzati
2.00mL)作为溶菌晦的待水解样、50℃水解5h得水解
样用于测定。
3.2化学发光检测条件
改变金胶制备过程中柠檬酸钠的用量,制得不同颗径的金胶,将其分别用于检测。实验表明,金的
催化数果与其颗径相关,其中19nm颗径的金胶作为试剂,发光强度最大。图4为其透射电镜图。
考察了金胶浓度、鲁米诺浓度及鲁米诺中NaOH浓度,对化学发光强度的影响。固定其它物质浓
度,改变金胶浓度,考察金胶浓度对化学发光强度的影响,结果如图5。随着金胶浓度的增大,发光强度
增强,当金胶浓度达0.05 mmol/L(以Au原子计)时,发光强度变化较缓。
当鲁米诺浓度和NaOH浓度较小时,化学发光强度随两者浓度的增加而增大;当鲁米诺浓度大于
0.05 mmol/L、NaOH浓度达10 mmol/L时,化学发光强度基本保持稳定。
本研究中金胶、鲁米诺及NaOH的浓度分别选择0.05,0.05和10 mmol/L。
3标准曲线、检出限
在以上选定条件下,对加人不同量溶菌酶的水解样进行测定。结果表明,当水解样中溶菌酶浓度在