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第39卷
分析化学( FENXI HUAXUE)研究简报
第1期
2011年1月
Chinesc Journal of Analytical Chemistry
95~98
DOI:10.3724/SP.J.1096.2011,00095
化学发光免疫分析检测人血清中的癌胚抗原
薛昐章竹君”张哓明
(陕西师范大学化学与材料科学学院,陕西省生命分析重点实验室,西安710062)
摘要基于辣根过氧化物酶(HRP)催化H2O2氧化3(4羟苯基)丙酸( PHIPPA),生成能发荧光的3(4羟苯
基)内酸二聚体,在乙腈介质中,在増强剂咪哗参与下,与双2,46三氯苯基」草酸酯(TCPO)和H12O2反应产生
强化学发光。用辣根过氧化物酶(HRP)标记癌胚抗原(CEA)单克隆抗体,通过CEA的双抗夹心免疫反应,建
立了简单、灵敏和快速检测人血清中的癌胚抗原(CEA)含量的化学发光免疫分析方法。CEA在1.0~80.0ug/L
范围具有良好的线性关系;检出限为0.3ug/L(SN=3),相对标准偏差(n=11)为3.9%。已成功用于人血清样
品中CEA含量的测定
关键词癌胚抗原;酶催化荧光反应;化学发光免疫分析
癌胚抗原( Carcinoembryonic antigen,CEA)是存在于细胞表面的富含多糖的蛋白复合物,分子量约
为15000~20000,多在结肠、乳房、肺腺癌和大多数上皮米源的肿瘤中表达。对血清中CEA进行定量检
测,在恶性肿瘤的诊断、评估病变范制、预测评估疗效、监测复发等方面发挥着重要的作用。检测CEA
的常用方法有放免法(RIA)和酶联免疫法( ELISA)。RIA法敏感性高,但存在放射性同位素损伤和污
染、不稳定等弊端,容易对操作人员造成伤害。 ELISA法稳定性好且简便易操作,但敏感性不及RIA
法。近年来发展了荧光免疫分析法、化学发光免疫分析法、脂质体免疫分析法?等,这些方法操作
筲便,灵敏度高。
化学发光分析方法与免疫分析相结合已经成为化学与医学交又的研究热点,它貝备了化学发光的
高灵敏度,也拥有免疫分析方法高特异性的优点,对提高目标物质定量分析的检出能力具有重要意
义劉。其检测反应多采用辣根过氧化物酶(HRP)催化对碘苯酚增强的鲁米诺同H2O2的化学发光反应。
已有多种试剂盒用于临床检测。与鲁米诺化学发光体系相比,过氧化草酸酵化学发光体系具有更高的
发光量子产率,通常可高达30%,且发光持续稳定时间长,能够通过较长时间成像或者在一定时间内对
发光进行积分,进一步提高测定灵敏度。文献[9采用异硫氰酸荧光素或8苯氨基-萘磺酸作为抗体的
标记物,对过氧化草酸酯(TCPO)化学发光体系进行免疫分析。由于标记物的测定不存在催化放大作
用,反应介质为水溶液,使TCPO化学发光体系的量子产率降低,灵敏度低于荧光免疫分析法。HRP能
催化3(4-羟苯基)丙酸( PHPPA)与H2O2的反应,可将其作为电子的供体来构建电位免疫传感器の。本
实验用HRP标记CEA抗体,通过双抗夹心法,在免疫反应完成后,二抗上的HRP催化H1O2氧化
PHPPA生成荧光物质3-(4羟苯基)丙酸二聚物( PHPPA Dimer)。在乙腈介质中,利用咪唑增强的
TCPO-E2O2- PHPPA Dimer化学发光反应进行化学发光测定。此方法简便、快速、仪器设备简单,灵敏度
高于 ELISA法和鲁米诺化学发光免疫法。
2实验部分
2.1仪器与试剂
MPI-A型多功能化学发光分析仪(西安瑞迈分析仪器有限公司);ACQ600超声波发生器(西安翔达
超声技术工程部);HC-3018R高速冷冻离心机(科大创新股份有限公司中佳分公司);精密pH计(上海雷
2010-0621收稿;201008-15接受
本文系中央高校基础研究基金(No,GK20091004)资助项目
wE-mail:zzj18(@hotmail.com
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池仪器厂);隔水式电热恒温培养箱(上海市跃进医疗器械一厂);XK96型微量振荡器(姜堰市新康医疗
器械有限公司)。
CEA诊断试剂盒(郑州博赛生物技术股份有限公司);乙腈(国药集団化学试剂有限公司)
5.0 mmol/L TCPO(自制)的乙腈溶液;1.0 mol/L H2O2-乙腈溶液;1.0 mmol/L咪唑(天津市远航化学品有限
公司)乙腈溶液;0.05 mol/L E2O2缓冲溶液;0.05molL3-(4羟苯基)丙酸( PHIPPA, Acros Organics公司)
缓冲溶液;H2O2,Na2CO3, NAHCO3,NaH2PO4,Na2HPO4,NaOH,H3BO3、Na2B4O1,CH1 COONA,三羟甲基氨
基甲烷(Tris),HCl,柠檬酸均购自西安化学试剂厂。TCPO和H2O2的乙腈溶液使用时再用相冏溶剂稀
释至所需浓度; PEPPA和H2O2水溶液用pH6.0磷酸盐冲溶液稀释至所需浓度。所有试剂均为分析
纯。水为离子交换水,再经石英蒸馏器亚沸蒸馏制得。
2.2人血清样品预处理
样品来自于新鲜的人体静脉血液。用于净的塑料收集新鲜的人血液,在不加入任何絮凝剂的状态
下,在室温中沉降30min后,以3000r/min离心10min,上层血清用小的样品收集器收集,储存在4℃冰
箱中待用。
2.3免疫分析方法
采用双抗体夹心法,将待测样本或CEA标准抗原加入到已包被有CEA単克隆抗体的96孔反应板
中,经过孵育洗涤后,加入HRP标记的抗CEA单克隆抗体。再次孵育,洗涤,拍千。再加人H12O2溶液
和 PHPPA溶液,振荡混匀1min,37C温育
10min。此时二抗上的HRP催化H1O2氧化
PEIPPA生成发荧光的 PHPPA的二聚体。用微
量加样器从各反应孔中各吸取50uL反应后
的溶液于另一96孔反应板中,加入H2O2(含
eE?sR
咪唑)后放入发光检测器,再加入TCPO乙腈
溶液,8§开始记录化学发光信号。实验流程
③ PHPPA△ Fluorescent PHIPPA dimer
见图1。
&C TCPO and H, O
Ym的人
Hrp-labclcd antibody
结果与讨论
图1实验过程
Fig 1 Procedures of proposed method
在免疫反应完成后的化学发光过程是基
于二抗上标记的HRP催化H2O2氧化 PHPPA,生成具有荧光的3-(4羟苯基)丙酸二聚体,然后H2O2将
TCPO氧化成高能量的活性中间体,荧光物质3-(4羟苯基)丙酸二聚体从活性中间体吸收能量而被激
发,当从激发态回到基态时产生化学发光。此
(CH, COOH
(CH, COOH (CH,),COOH
定量检测过程依赖于酶催化反应程度和化学
发光反应条件。因此,TcPO,H,O眯唑和()21
HRP
H22
+2HO
PHPPA的浓度以及溶液条件等因素在实验中
被优化。酶催化反应和化学发光反应机
理见图2。
3.1HRP酶催化反应条件优化
1.1酶催化反应中缓沖溶液pH值对发光
OH+ & -6 PPPA dimer - IPHPPA dimery
强度的影响在HRP酶催化反应中,缓冲溶
液的pH值对生成的荧光物质3-(4羟苯基)丙
一( PAPPA dimer)'