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研究报告
DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201702015
大蒜提取物对铜绿假单胞菌生物膜形成的影响
丁荣荣,陈贵堂,杨志萍,王海翔,綦国红
(中国药科大学工学院,江苏南京,21198
摘要研究了大蒜提取物对铜绿假单胞菌PAO1生物膜形成的影响。通过对铜録假单胞薗上AO1生物膜以及
与生物膜形成相关因素的测定,结果表明大蒜提取物在不影响PAO1生长的浓度条件下,能抑制其生物膜的形
成、胞外多糖的产生以及浮游现象;与阿奇骣素具有协同作用。因此,大蒜提取物通过千扰铜绿假单胞菌PAO
群体感应系统来抑制其生物膜的形成,降低与生物膜形成相关特性的表达。
关键词铜绿假单胞菌;生物膜;大蒜提取物;群体感应抑制
铜绿假单胞菌( Pseudomonas aeruginosa,简称
群体感应抑制剂广泛分布于自然资源中,包括药
PA)广泛分布于健康人体皮肤、呼吸道和消化道等部用植物、食用果蔬和海藻等。人们熟知大蒜具有抗肿
位,是人体常见条件致病菌。也是医院间发生感染的瘤,提高机体免疫力,抗氧化等多种生理活性?。而
第三大致病菌,可引起多种急性或慢性感染,如肠道且大蒜在抗感染以及抗菌方面有很好的应用前
慢性炎症、泌尿系统感染、肺炎等疾病。特别是感染景°。但大蒜在群体感应抑制方面的研究目前在
后产生的生物膜,对PA菌本身产生保护作用,増加国内鲜有报道。
了治疗难度,也促生大量耐药菌株的出现。由于
因此,本实验拟研究大蒜提取物对PA菌生物膜
PA菌对多种抗生素的高效耐药性,对于免疫力低下形成以及生物膜形成相关因子产生的影响,研究视角
或患有其他病症的患者具有严重的危害。因此,对不同于已有研究大蒜素对铜绿假单胞菌生物膜及毒
PA菌致病性和耐药性的研究具有重要意义。
力因子表达的影响,为大蒜的进一步开发应用提供理
很多革兰氏阴性菌通过群体感应( Quorum sens-论依据。
ing,简称QS)方式调控某些特定生理性状的表达,如1材料与方法
生物浮游、生物膜的形成、抗菌肽的产生、毒性因子
等。即细菌能自发产生、释放特定的小分子物质,并1.1菌株
能感知其浓度变化,调节自身特定基因的表达,从而
铜绿假单胞菌PAO1,本实验室保藏
改变群体行为?。PA菌的致病性受其QS系统的调1.2材料与试剂
节,以扩散性小分子为信号物质调控特定基因表达,
白皮大蒜购自于当地农贸市场;甲苯(分析纯)
涉及细胞毒素、致病因子、生物被膜等一系列细菌特上海凌峰化学试剂有限公司;苯酚(分析纯),国药集
征性表型。因此,通过群体感应抑制( Quorum团化学试剂有限公司;浓硫酸(分析纯),南京化学试
sensing inhibition,简称QSI)原理来控制PA菌致病性剂股份有限公司;胰蛋白陈(生物试剂),北京奥博星
的研究具有广阔的发展前景。其机制不同于目前抗
生物技术有限责任公司; YEAST, EXTRACT Oxoid
生素控制细菌感染的机制,即不是以抑制或杀灭致病
Ld;吖啶橙( Acridine Orange), Sigma;注射用阿奇霉
茵为目的,而是通过阻断其群体感应通路来减少致病素,南京海辰药业股份有限公司。
因子的表达,不会对致病菌生长产生选择压力,不会
仪器与设备
导致严重的抗药性问题1。
HZC-250恒温振荡培养箱,苏州太仓实验设备有
限公司;Elx800多功能酶标仪,美国伯腾仪器有限公
第一作者:硕土研究生(禁国红副教授为通讯作者,E-mail:gh司;TU-1901双光束紫外可见分光光度计,北京普析
box@163.com)
通用仪器有限责任公司; Microscope、 Eclipse80i光学
基金项目:细菌群体感应对鱼虾腐败过程的调控作用及其分子
机制(30
显微镜,日本 Nikon;TGL-16G离心机,上海安亭科学
收稿日期:2016-08-03,改回日期:2016-09-13
仪器厂。
207年第4巻第2思(总第350期)85
万方数据
食品与发酵エ业FO0 AND FERMENTATION INDUSTRIES
1.4实验方法
物。再置于37℃静置培养8h,取出,结晶紫染色,显
1.4.1大蒜提取物的制备
微镜观察,方法同1.4.4.1
选成熟、干燥的蒜头,去蒂、分瓣、剥皮,用清水漂1.4.6与抗生素的协同作用
洗,除去杂质。称取150g蒜粒,加300mL甲苯,用
按文献[14],PAO1按1%接种量接种于新鲜LB
粉碎机将蒜粒捣成糊状,静置过夜,3000r/min离心培养基,培养至OD。onm值为0.4后,进行分组实验,
10min,得上清,加入150mL无菌蒸馏水,揽拌混匀,对照组不加阿奇霉素,不加提取物;实验组一组加阿
室温静置24h,得水相,无菌过滤,分装,于-18℃保奇霉素,加提取物,另一组加阿奇霉素,不加提取物。
疲,备用。粗提物的质量浓度为1g/mLo
每组加人等体积菌液,阿奇霉素终质量浓度为10
1.4.2对铜绿假单胞茵最小抑菌浓度(MIC)的测定ug/mL或5pg/mL。大蒜提取物终质量浓度60mg
按文献[9]方法,铜绿假单胞菌PAO1活化后,按mL。37℃静置培养24h,测定OD值,按公式(1)计
1%接种量接种于新鲜LB培养基,37℃,150r/min算抑制率。
振荡培养至OD。om为0.4。按菌液:提取物比例为1.4.7对胞外多糖产生的护制作用
9:1进行混合,大蒜提取物最终质量浓度分别为50、
PAO1培养至OD。onm值为0.4。分装至锥形瓶
60、70、80mg/mL。对照组为LB培养基。于37℃,里,加入不同浓度的提取物,37℃培养振荡培养20
150r/min振荡培养24h,观察抑制生长的最低h。取菌液12000r/min离心10min,得上清,用无菌
浓度。
水稀释,用苯酚-硫酸法测定胞外多糖。
对铜绿假单胞茵生长的制作用
4.8对浮游的护制作用
按1.4.2方法制备含有不同浓度大蒜提取物的
按文献[14],在9mL含有1.5%琼脂的LB固体
菌液后,分别在0、2、4、6、8、10h时取200L培养液培养基中,加入1mL不同浓度的提取物,混匀后倾注
加入96孔板中用酶标仪测定OD。值,绘制成生长平板,在平板上滴加2LPAO1培养液,无菌风吹干
曲线。
后于37℃静置培养24h,观察结果。
4.4对铜绿假单胞茵生物膜形成的抑制作用
2结果与分析
1.4.4.1光学显微镜对生物膜的定性观察
按1.4.2方法制备含有不同浓度提取物的菌
对铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度(MIC)
液,分装于锥形瓶中,将1.5cmx1.5cm的无菌玻
根据PAO1的生长情况,以及测定培养物的OD
璃片置于锥形瓶内,37℃静置培养48h后,弃培养值,确定大蒜提取物对PAO1的最小抑菌浓度是为80
液,添加新鲜LB培养基和提取物后继续静置培养mg/mL
48h。
2.2对铜绿假单胞菌生长的抑制作用
取出玻璃片,无菌水冲洗表面浮菌,45℃干燥
为进一步确定提取物在MIC浓度下对铜绿假单
30min。0.2%的结晶紫溶液染色2min。无菌水洗胞菌生长是否有抑菌作用,对生长曲线进行了测定。
掉多余的染色剂,45℃干燥30min。用光学显微镜由图1可知,提取物在60、7