化学发光酶免疫法检测猪肉中氯丙嗪残留.pdf

第40卷
分析化学( FENXI HUAXUE)研究报告
第9期
2012年9月
Chinese Journal of Analytical Chemistry
1397ー1402
DOI:10,3724/SP,J.1096.2012.20054
化学发光酶免疫法检测猪肉中氯丙嗪残留
孙文佳沈玉栋孙远明雷红涛王弘曾道平杨金易
(广东省食品质量安全重点实验室,华南农业大学食品学院,广州510642)
摘要采用棋盘滴定法确定包被抗原浓度和抗体稀释侪数,通过单因素实验优化了竟争反应时间、磷酸盐
缓冲液浓度、甲醇含量、pH值等参数,建立了氯丙嗪的间接竞争化学发光酶免疫检测方法,并考察了方法的特
异性、灵敏度和稳定性。结果表明,最佳反应条件为包被抗原浓度为0.05gL;氯丙嗪抗体稀释32000倍;体
系缓冲液为含10%甲醇、0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)。本方法的ICs为0.12ug;檢出限为0.02ug;线
性范围0.02~24.78pgL;批内和批间相对标准偏差均小于10%。与其它结构类似物没有明显交叉反应。猪
肉检测的平均回收率为87.4%~105.6%,与高效液相色谱方法的相关性良好。本方法具有较高的灵敏度和较
好的稳定性。
关鍵词氯丙嗪;间接竞争;化学发光酶免疫方法;氯丙嗪残留;猪肉
引言
氯丙嗪( Chlorpromazine,CPZ),属于吩噻嗪类药物,为中枢多巴胺受体阻断剂,具有镇静、抗精神
病、降低体温及基础代谢等作用。不法商贩在动物运输过程中大剂量违法使用氯丙嗪,以降低动物的维
持需要,减少运输途中的失重和死亡率。其药物和代谢物的残留对人体有致白细胞减少、肝功能障碍
皮炎、迟发性运动障碍等毒副作用?。因此欧盟、日本和中国等对氯丙嗪在动物性食品的残留量均有
规定。检测氯丙嗪残留比较常规的方法有分光光度计法、荧光光谱法、液相色谱法?、液相色谱一质
谱联用法和电化学法の等,这些方法或仪器昂贵,或样品处理复杂,较难广泛应用于大规模高通量检
测中。
化学发光分析法具有简便、灵敏、无污染等优点,在环境食品、生物及医药检测中有较大发展1
Wang等"]用固定联吡啶钉电致化学发光法测定CPZ;唐国风等?用反相流动注射技术与鲁米诺-次氯
酸钠化学发光体系结合测定CPZ;Li等?用毛细管电泳法与电化学发光法结合测定CPZ。但基于间接
竞争酶联免疫的化学发光分析法检测CPZ尚未见文献报道。化学发光酶免疫法是化学发光法和酶免
疫分析法结合的产物,同时具有化学发光法的高灵敏性和免疫分析法的高特异性明。本实验利用
CPZ药物与CPZ包被偶联抗原竟争性结合CPZ抗体,其竞争结合率与药物浓度呈一定的线性关系,经
过孵育及洗涤步骤,然后加人酶标记物,再经过孵育及洗涤步骤后利用酶催化鲁米诺体系发光值进行定
量,建立了间接竞争化学发光酶免疫法( Indirect competitive chemiluminescent enzyme immunoassay
IC-CLEIA)检测CPZ残留。实验表明,本方法具有较高的选择性和灵敏度,并具有良好的重复性和稳定
性。应用本方法测定猪肉中CPZ的含量,并与液相色谱方法对比,结果满意。
2实验部分
2.1仪器与试剂
9%孔可拆卸发光板(深圳金灿华实业有限公司);微孔板恒温振荡仪(合肥艾本森科学仪器有限公
司); EYELA旋转蒸发仪(上海爱朗仪器公司); Wellwash MK2洗板机(美国 Thermo公司); Wallac
VICTOR31420多功能酶标仪(美国PE公司);高效液相色谱仪( Waters公司)。
氯丙嗪抗体、包被抗原(本实验室制备);氯丙嗪(纯度99%,美国L公司);异丙嗪、氟奋乃静、2氯
2012-01-15收稿;2012-03-19接受
本文系国家自然科学基金(No.30901005)、国家科技支撑计划(No.2012BAD31B03)、广东省科技计划项目(Nos.2011A09020029
2010A0320000-4、2010A09020084)资助项目
ME-mail:yjy361@163.com
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分析化学
第40卷
吩噻嗪、奋乃静、氟哌啶醇、乙酰丙嗪(纯度均为98%,广东省食品药品监督管理局);无水甲醇(色谱级,
Sigma公司);HRP标记的羊抗兔1gG抗体(武汉博士德生物工程有限公司);鲁米诺化学发光底物液
主要成分为鲁米诺,1.25×103molL,pH9.0)、底物缓冲液(主要成分为H1O2,0. Imol/L,pH7,0),均购自
珠海丽珠试剂有限公司;包被液、稀释液、洗涤液、封闭液均按文献[2?]的方法配制。实验用水为
18.2m2cm超纯水。其它试剂均为国产分析纯;猪肉样品购自广州市某超市。
2.2实验方法
实验步骤用包被液将CPZ-BSA稀释至0.05gL,加到酶标板孔中,每孔100L,于4℃储存
过夜;甩干孔中液体,用洗涤液洗涤6次,甩干。每孔加入封闭液120uL,于37℃温箱中孵育3h,甩干,
置于37℃烘箱中烘干备用
用稀释液将CPZ药物稀释成不同浓度的标准品溶液;CPZ抗体稀释3200倍;每孔加人CPZ标准
液和CPZ抗体各50L,37℃轻振反应40min,洗涤液洗涤6次,拍干;加人1:10000稀释的HRP-1gG羊
抗兔100uL/孔,37℃轻振反应20min,洗涤6次,拍干;加入鲁米诺化学发光底物液与底物缓冲液按体
积比1:1的混合液100μL/孔,立即用多功能酶标仪测定各孔425nm处的发光值( Relative light unit,
RLU)。
以各标准品发光强度与零浓度标准品发光强度的比值为纵坐标,标准品浓度的对数为横坐标,做标
准曲线。ICs为发光强度达到零浓度标准品发光强度一半时所对应的CPZ浓度
2.2.2实验条件的优化通过棋盘滴定法确定包被抗原浓度和抗体稀释倍数。通过单因素实验,考察
竞争反应时间、不同离子强度的磷酸盐绶冲液(PBS)、甲醇溶液以及pH值对 C-CLEIA检测性能的影
响。以 RLU./IC的值作为评价各影响因素的标准,比值越大则代表灵敏度越高,重复性越好。
2.2.3猪肉样品提取与净化取40g匀质的猪肉,加入10.0mL乙酸乙酯,高速匀浆10s后振荡提取
10min;在室温下,以4000r/min离心5min,将上清液转至一个新的离心管中;在残渣中加入5.0mL乙
酸乙酯,振荡样品5min,离心,取上清液,合并到第1次上清液管中。在全部上清液中加入5mL正己
烷,剧烈振荡1min;将乙酸乙酯层溶液转移至鸡心瓶中,用5.0mL正己烷重复上述操作次;将乙酸乙
酧溶液在40℃旋转蒸发至于,用2.0mL甲醇进行复溶。取出1.0mL复溶液,加入19.0 ml PBS溶液,混
,该稀释样品即可用于检测
2.2.4精确度和准确度测定取3份猪肉样品分别添加CPZ标准品,得到CPZ含量为2.0,10.0和
30.0μgkg的猪肉样品,按2.2.3节的方法处理后再进行测定。每个样品做6孔平行,连续测定3次,分
别计算批内和批间相对标准偏差和回收率。
2.2.5高效液相色谱验证取3份猪肉样品分别添加40.0,80.0和240.0pg/ kg CPZ标准品。取10.0g
上述样品,按2.2.3节的方法处理,用2.0mL甲醇复溶后,取10L进行测定。同时将该复溶液稀释50倍
后,取50HL用 IC-CLEIA测定。
液相色谱条件:色谱柱 Alantis dc18(60mmX