GB 13091-91 饲料中沙门氏菌的检验方法.pdf

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中华人民共和国国家标准
饲料中沙门氏菌的检验方法
GB13091--91
Method for determination of Salmonella
in feeds
本标准等效采用国际标准SO65791981饲料中沙门氏菌检验方法》
1主题内容与适用范围
本标准规定了饲料中沙门氏菌的测定方法。
本标准适用于配合饲料(包括混合饲料)和动物性单一饲料中沙门氏菌的检验。
2引用标准
GB4789.1食品卫生微生物学检验总则
3原理
根据沙门氏菌的生理特性,选择有利于沙门氏菌增殖而大多数细菌受到抑制生长的培养基,进行选
择性增菌、选择性平板分离,以求检出饲料中的沙门氏菌。
4设备和材料
4.1天平:感量1g,最大秤量1000g
4.2显微镜:1500×。
4.3温箱:36士1℃,43±1℃
4.4冰箱:普通冰箱
4.5均质器:8000~10000r/min
4.6广口三角瓶:500mL
4.7三角瓶:250mL
4.8水浴锅:45±1℃,55士1℃,771℃
4.9吸管:1、5、10mL
4.10平皿:皿底直径9cm。
4.11电炉
4.12酒精灯。
4.13接种棒:镍铬丝。
4.14试管。
4.15载玻片。
4.16试管架。
4.17干燥箱:50~250±1℃。
4.18乳钵。
国家技术监督局1991-07-16批准
1992-04-01实施
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GB13091-91
4.19温度计,100C
4.20高压灭菌器:2.5kg
5培养基和试剂
详见附录A(补充件)
5.1缓冲蛋白陈水。
5.2四硫磺酸钠煌绿增菌液。
5.3亚硒酸盐胱氨酸增菌液。
5.4酚红煌绿琼脂。
5.5DHL琼脂。
5.6营养琼脂
57三糖铁琼脂。
5.8尿素琼脂。
5.9赖氨酸脱羧试验培养基。
5.10V-P反应培养基
5-11肌酸溶液。
5.12a-萘酚乙醇溶液。
5.13氢氧化钾溶液。
5.14靛基质反应培养基
5.15柯凡克试剂
5.16半乳糖苷酶试剂。
5.17半固体营养琼脂
5.18盐水溶液。
6样品采集
参照GB4789.1的要求执行。
7检验程序
沙门氏菌检验程序如下:
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GB13091-91
检验样品25g+颈增菌培养基(缓冲蛋白水)225mL
在36±1℃培养16~20h
取预增菌培养物0mL接种于四硫酸钠煌绿增菌液中
在43℃培养1820h
取预增培养物10mL接种于亚新酸盐氨酸增液中,
在361℃培养18~24h成48h
煌绿琼脂(平36】℃培2040h,
DH琼脂(平血)36±1℃培养20~24h
如有需要培养至48h
如有需要,培养至48h
每平血取5个有沙门氏特征的落
接种在营养琼脂上,36±1℃培养18~24h
生化鉴定
血清鉴定
结果报告
8操作
8.1预增菌培养
取检验样品25g,加入装有225mL缓冲蛋白水的500mL广口瓶内(粒状可用均质器,以8000
10000r/min打碎1min,或用乳钵加灭菌砂磨碎在36±1℃培养16~20h
8.2选择性增菌培养
取预增菌培养物10mL,接种于装有100mL四硫磺酸钠煌绿增菌液的培养瓶中,另取预增菌培养
物10mL,接种于装有100mL亚硒酸盐胱氨酸增菌液培养瓶中,四硫磺酸钠培养瓶在43℃培养。亚硒酸
盐胱氨酸培养瓶在361℃培养。
8.3分离培养
取8.2培养物一接种环,分别划线接种在酚红煌绿琼脂平皿和DEL琼脂平皿上为取得明显的单个
菌落,取一环培养物,接种两个平皿,第一个平皿接种后,不烧接种环,连续在第二个平皿上划线接种,将
平皿底部向上在36±1℃培养。必要时可取82培养物重复培养一次。
8.3.1培养20~24h后,检查平皿中是否出现沙门氏菌典型菌落,生长在酚红煌绿琼脂上的沙门氏菌
典型菌落,使培养基颜色由粉红变红,菌落为红色透明;生长在DHL培养基上的沙门氏菌典型菌落,为
黄褐色透明,中心为黑色,或为黄褐色透明的小型菌落。
8.3.2如生长微弱,或无典型沙门氏菌落出现时,可在36±1℃重新培养18~24h再检验平皿是否有
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GB13091-91
典型沙门氏菌菌落。
8.3.3辨认沙门氏菌菌落,在很大程度上依靠经验,它们外表各有不同,不仅是种与种之间,每批培养
基之间也有不同,此时,可用沙门氏菌多价因子血清,先与菌落作凝集反应,以帮助辨别可疑菌落。
8.4鉴定培养
从每种分离平皿培养基上,挑取5个被认为可疑菌落,如一个平皿上典型或可疑菌落少于5个时,可
将全部典型或可疑菌落供进行鉴定。
挑选的菌落在营养琼平皿上划线培养,在361℃培养18~24h,用纯培养物作生化和血清鉴定。
8.4.1生化鉴定
将从8.4培养基上挑选的典型菌落,接种在8.41.1~8.4.1.6培养基上。
8.4.1.1三糖铁培养基
在琼脂斜面上划线和穿刺,在36土1℃培养24h.培养基变化见表1
表1三糖铁培养基变化表
培养基部位
培养基变化
黄色
乳糖和蔗糖阳性
琼脂斜面
红色或不变色
乳糖和蔗糖阴性
底端黄色葡萄糖阳性
红色或不变色
葡萄糖阴性
琼脂深部
穿刺黑色
形成硫化氢
气泡或裂缝
葡萄糖产气
典型沙门氏菌培养基,斜面显红色,底端显黄色,有气体产生,有90%形成硫化氢,琼脂变黑。
当分离到乳糖阳性沙门氏菌时,三糖铁斜面是黄色的,因而证实沙门氏菌,不应仅仅限于三糖铁培
养的结果。
8.4.1.2尿素琼脂培养基
在琼脂表面划线,在361℃培养24h,应不时检查如反应是阳性,尿素极快的释放氨,它使酚红的
颜色变成玫瑰红色~桃红色,以后再变成深粉红色,反应常在2~24h之间出现。
8.4.1.3赖氨酸脱羧反应培养基
将培养物刚好接种在液体表面之下,在36土1℃培养24h,生长后产生紫色,表明是阳性反应。
8.4.1.4V-P反应培养基
将可疑菌落接种在V-P反应培养基上,在361℃培养24h,取培养物0.2mL于灭菌试管中,加肌
酸溶液2滴,充分混匀后加a-萘酚乙醇溶液3滴,充分混匀后再加氢氧化钾溶液2滴,再充分振摇混匀,在
15min内,形成桃红色,表明为阳性反应。
8.4.1.5靛基质反应培养基
取可疑菌落,接种于装有5mL胰蛋白胨色氨酸培养基的试管中,在361℃培养24h,培养结束后,
加柯凡克试剂1mL,形成红色,表明是阳性反应。
8.4.1.6检查半乳糖苷酶的反应
取一接种环可疑菌落,悬浮于装有0.25mL生理盐水的试管中,加甲苯1滴,振摇混匀,将试管在36
士1℃水浴锅中放置数分钟,加ONPG试液025mL,将试管重新放入36±1℃水浴锅中24h,不时检查,
黄色表明为阳性反应,反应常