NYT 2309-2013 黄曲霉毒素单克隆抗体活性鉴定技术规程.pdf

ICS65.020
B16
N
中华人民共和国农业行业标准
NY/T23092013
黄曲霉毒素单克隆抗体活性
鉴定技术规程
Technical rules for activity identification of monoclonal
antibodies against aflatoxins
2013-05-20发布
2013-08-01实施
中华人民共和国浓业部发布
Y/T2309-2013
前
本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草。
本标准由农业部种植业管理司提出并归口。
本标准起草单位:中国农业科学院油料作物研究所、农业部油料及制品质量监督检验測试中心。
本标准主起草人:李培武、李冉、」小霞、周海燕、张奇
黄曲霉毒素单克隆抗体活性鉴定技术规程
1范
本标准规定了黄曲霉毒萦单克隆抗体的活性鉴定方法
本标准适用于黄曲霉毒素单克隆抗体的活性鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注目期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
试剂
除非另有说明,均使用分析纯试剂和GB,T6682规定的一级水。
3.1碳酸钠(Na2CO3):分析纯。
3.2碳酸氢钠( NAHCO3):分析纯。
3.3十二水合磷酸氢二钠(Na2HPO?12H2O);:分析纯
3.4磷酸二氧钾(KH2P(O1):分析纯
3.5氯化钠(NaC):分析纯。
3.6氯化钾(K(U):分析纯。
3.7柠檬酸(CH1-O。?H2O):分析纯。
3.8过氧化氢尿素[CO(NH2)2?H2O2]:分析纯
3.9黄曲霉毒素完全抗原:纯度≥98%。
3.10卵清白蛋白( Ovalbumin,OVA)。
3.113,3',5,5-四甲基联苤胺(3,3,5,5'- Tetramethylbenzidinc,TMB)
3.12甲醇(CH3OH):分析纯
3.13无水乙醇(CH3CH12OH):分析纯
3.14吐温-20( Tween-20)。
3.15羊抗鼠IgG辣根过氧化物标二抗。
3.16黄曲莓毒素标准品(黄曲霉毒素B、黄曲莓毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、黄曲霏毒素
M,即AFB1、AFP2、AFG2、AFG2、AFM1):纯度≥99%。
3.17黄曲篝毒素标淮储备液:确称取黄曲霉毒素B,黄曲霉毒素B、黄曲霉毒素G1、黄曲露毒素G
和黄曲篝毒素M标准样品,用甲醇(3.12)配制成0.100mg/mL.的储备液。
3.18黄曲霹毒素标准工作液:准确移取鼓曲霉毒素B、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒索G1、黄曲霉毒素
和黄曲繹毒素M1标准储备液,用甲皞稀释成工作液(浓度均为:0.01ng/ml、0.1ng/mL、1ng/mi
0ng/mL.和100ng/mI)。
3.19磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液):称取2.9gNa2HP(O)?12H2O、0.2gKH2PO1、8.0 g Nacl和0.2g
KCl溶于纯水并定容至1L超纯水中,调pH至
3.20磷酸盐吐温缓冲液(PBST缓冲液):称取2.9 g Na] HF(O)?12H1O)、0.2gKH2P(O1、8.0 g Naci
NY/I"2309-2013
和0.2gKC1,加水并定容至1L,调pH至7.4,最后再加入0.5mL叶温-20混匀。
3.21包被缓冲液:称取1.59gNa2(XO)2和2.93 g NAHCO。加水定容至1L
3.22封闭液:称取1.5g卵清白蛋白(OVA)溶于100 ml PBST缓沖液中
23底物
3.23.1底物缓冲液:称取1.84gNa2HPO4?12H2(O)和0.93gCaH2()。?H2(O加水定容至100mL
3.23.2底物A储存液:准确称取0.10mg3,32,5,52-四甲基联苯胺(TMB),定容至50mL无水乙醇
中,4℃避光保存。
3.23.3底物B储存液:取3g过氧化氢脲,加水定容至100nmL,4℃C避光保存
3.23.4底物显色液:吸取9.5mL底物绶冲液(3.23.1),底物A储存液(3.23.2)0.5mL,底物B储存
液(3.23.3)32ッL,混,现配现用
3.24终止液:2mol/ILH2SO2。
4仪器设备
4.1酶标仪
4.2天平:感量0.0001g
4.3酶标板:96孔
4.4恒温培养箱
方法原理
采用间接竞争联免疫吸附测定方法( EISA)方法对黄曲霉毒素抗体与不同黄曲暮毒素的交叉反
应率,以反应率表示抗体识判黄曲霉毒素的特异性:通过间接非竞争 ELISA方法对不同浓度抗原、抗体
的结合强度进行检测,通过计算得到黄曲霉毒素单克隆抗体亲和力
6活性测定(以黄曲辱毒素M1为例
方法
6.1.1抗体特异性测定
6.1.1.1包被抗原和待检单克隆抗体工作度确定
包被:用包被缓冲液(3.21)配制抗原AFM-BSA溶液浓度到0.5g/mL、0.25g/m
0.125gg/mlL、0.0625g/mL,各浓度横向包被酶标板,每孔加入100uL,每个浓度2个重复,置恒温箱
中37℃包被2h;
6.1.1.1.2封闭:磷酸盐吐混缓冲液(3.20)250山洗板3次?每孔加入150pL封闭液(3.22),置恒温
箱中37℃孵育45min,磷酸盐吐温缓冲液(3.20)250L洗板3次
6.1.1.13抗原抗体反应:磷酸盐缓冲液(3.19)配置待检单克隆抗体溶液到1mg/mL,按体积比
5000、1:10000、1:150001:20000、1:30000进行逐级稀释后配制成系抗体溶液纵向每孔加
入100p,每个浓度2个重复,置恒温箱中37℃孵育0.5h,礫酸盐吐温缓冲液250L洗板3次
6.1.1.1,4海标二抗反应:用磷酸盐缓冲液将羊抗鼠IgG辣根过氧化物酶标二抗(3.15)稀释1000
倍,毎孔加入100l1-.置恒温箱中37℃孵育45min,磷酸盐吐温缰冲液250L洗板ぶ次
显色:加底物显色液(3.23.4),每孔加入100xL,置恒温箱中37℃作用15min;
6.1.1.1.6终止显色:每孔加人50pL终止液(3.24)
6.1.1.1.17读数:加入终止液后10min内酶标仪测定OD)-m值
6.1.1.1.8工作浓度确定:选择OD4xm值最接近1.0的包被抗原浓度及抗体浓度作为抗体特异性测