GBT 14926.46-2008 实验动物 钩端螺旋体检测方法.pdf

ICS65.020.31
B 4
的秒
中华人民共和国国家标准
GB/T14926.46-2008
代?GB/T14926.462001
实验动物钩端螺旋体检測方法
Laboratory animal-method for examination of Leptospira spp
2008-12-03发布
2009-03-01实施
中国国家标准化管理委员会发布
GB/T14926,46-2008
前言
GB/T14926《实验动物》共54个部分,为不同微生物和病毒检测技术方法。
本部分自实施之日起代替GB/T14926.46-2001《实验动物钩端螺旋体检测方法》
本部分与GB/T14926.46-2001相比主要技术差异如下:
原理部分增加显徵镜凝集试验原理
b)原标准中“6.1试管凝集实验”修改为“显微镜凝集实验”;“6.1.2.2表1钩端螺旋体定量
显凝试验操作方法”更改为“钩端螺旋体定量显微镜凝集试验操作方法”;
修改原标准中所有关于酶联免疫吸附试验的内容
d)在原标准中增加了“7结果判定”
本部分由全国实验动物标准化技术委员会提出并归口。
本部分由全国实验动物标准化技术委员会负责起草。
本部分主要起草人:范薇、田克恭、贺争鸣。
本部分所代替标准历次版本发布情况为:
GB/T14926.46--2001
GB/T14926.46-2008
实验动物钩端螺旋体检測方法
1范围
GB/T14926的本部分规定了实验动物钩端螺旋体的检测方法。
本部分适用于犬钩端螺旋体的检测。
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过GB/T14926的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文
件,其随后所有的修改单(不包括樹误的内容)或修订版均不适用于本部分,然而,鼓励根据本部分达成
协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本
部分。
GB/T14926.42实验动物细菌学检测标本采集
GB/T14926.43实验动物细菌学检测染色法、培养基和试剂
GB/T14926.50实验动物酶联免疫吸附试验
3原理
钩端螺旋体抗原与相应特异性抗体相遇,在适宜的电解质存在下发生凝集现象,此种凝集一般须用
暗视野显徵镜检查。
钩端螺旋体抗原与待检血清中的特异性抗体结合,形成抗原抗体复合物。此抗原抗体复合物仍保
持其抗原活性,可与相应的第二抗体酶结合物结合。在酶的催化作用下底物发生反应,产生有色物质。
颜色反应的深浅与待检血清中所含有的特异性抗体的量成正比。
4主要设备和材料
1普通恒温培养箱
4.2实体显微镜。
4.3恒温水浴箱
4.4高速离心机。
4.5超声波细胞粉碎器
4.6酶标仪。
4.7微量加样器,容量5aL~50L和50L~200uL。
5培养基及试剂
5.1犬型钩端螺旋体标准抗原。
5.2标准阳性血清。
5.3标准阴性血清。
5.4生理盐水
5.5显镢镜凝集抗原:各群钩端螺旋体标准株接种 Korthof培养基,28℃培养5d~7d。取样作暗视
野显镜检査,每400倍视野不少于50条,运动活泼并无自凝现象者,可作为抗原。
5.6 ELISA抗原
5.6.1钩端螺旋体培养:各群钩端螺旋体标准株接种 Ortho培养基,28℃培养5d~7d。
GB/T14926.46~-2008
5.6.2生长良好的培养物用10000r/min离心30min,沉淀用PBS在相同条件下洗2次。
5.6.3上述沉淀用PBS悬浮,超声波打碎后,10000r/min离心20min,上清即为 ELISA抗原
5.7酶结合物:辣根过氧化物酶标记羊或兔抗犬IgG抗体,辣根过氧化物酶标记葡萄球薗蛋白A(SPA)。
5.8阳性血清:钩端蠔旋体免疫SPF犬所获得的血清,或自然感染犬后所获得的血清。
5.9阴性血清:无钩端螺旋体感染犬血清。
5.10培养基和试剂溶液的配制:参照GB/T14926.43和GB/T14926,50执行。
6检测方法
6.1显微鏡凝集实验
6.1.1检测程序
检测程序见图1。
虹清
倍比稀释
加入标准抗原「37℃温箱2h
结果判定
凝集
不凝集
效价大于等于1:20阳性
阴性
结果报告
图1检測程序
6.1.2操作步骤
6.1.2.1采样
采血、分离血清。采样方法参照GB/T14926.42执行
6.1.2.2血清稀释
参照表1进行。
表1钩端螺旋体定量显微镜凝集试验操作方法
凹孔板编号
2
10
11
12
生理盐水/mL
0.160.10.10,10,10.10.10.1「0.1
0.1
待检血清/m
o.04?0.10.10.110.1不0.10.110.10.11弃去0.1
阴性血清/mL
0.1
阳性血清/mL
0.1
标准抗原/mL
0.110.10.10.10.1「0.10.10.10.10.10.1「0.1
血清最终稀释度1/10」1/201/40「1/801/1601/3201/6401/12801/256?