聚乙烯醇-海藻酸钙固定化柚苷酶.pdf

1 3 8 2 0 1 1 ， V o 1 3 2 ， N o 0 3 良 品 科 学 生物工程 聚乙烯醇 一 海藻酸钙固定化柚苷酶 雷生姣 ，王 可兴 ， 吕晓燕 ，潘思轶 ( 华中农业大学食品科学技术学院，湖北 武汉4 3 0 0 7 0 ) 摘要：利用聚乙烯醇( P V A) 一 海藻酸钙为载体，通过戊二醛交联，制备水不溶性的固定化柚苷酶凝胶颗粒。结果 显示 ：添加戊二醛和延时包埋法制备的固定化酶凝珠活力较高。固定化酶的优 化工艺为： 以9 0 g 1 0 0 mL P V A 与 1 0 g 1 0 0 m L海藻酸钠为载体 ，固化剂 C a C h的质量浓度为 1 0 g 1 0 0 m L，酶液质量浓度 2 0 mg m L，固定化 时间 l O h 。 同时对固定化酶 与游 离酶的性质进行 比较研究：柚苷酶经 P VA一 海藻酸钙固定化后，其反应最适 p H值和最适温度 没有改变 ，但热稳定性提 高 ，重 复使用 6次仍保持 6 0 的酶活 力。 关键词 ：聚 乙烯醇；海藻酸钙；固定化 ；柚苷酶 I mmo b i l i z a t i o n o f Na r i n g i n a s e o n PVA Ca l c i u m Al g i na t e Ge l L E I S h e n g q i a o ，WAN G K e x i n g ，L i J X i a o y a n ，P A N S i y i * ( Co l l e g e o f F o o d S c i e n c e a n d Te c h n o l o g y ， Hu a z h o n g Ag r i c u l t u r a l Un i v e r s i t y ， W u h a n 4 3 0 0 7 0 ， Ch i n a ) A b s t r a c t ：I n t h i s s t u d y ， c o mp o u n d g e l s o f p o l y v i n y l a l c o h o l ( P V A) 一 c a l c i u m a l g i n a t e w e r e c h o s e n a s t h e i n s o l u b l e c a r r i e r t o i mmo b i l i z e n a r i n g i n a s e c r o s s l i n k e d wi t h g l u t a r a l d e h y d e T h e r e s u l t s s h o we d tha t a d d i n g g l u t a r a l d e h y d e a n d d e l a y e mb e d d i n g we r e mo r e e ffe c tiv e t han the o the r me tho d s Th e o pti ma l c on d i t i on s f o r na r i n g i n ase i mmo bi l i z a t i on we r e o bt a i ne d a s f o l l owi ng s ： P VA at 9 0 1 0 0 mL， s o d i u m a l g i n a t e 1 0 g 1 0 0 mL， Ca Ch 1 0 g 1 0 0 mL， an d e n z y me c o n c e n t r a t i o n a t 2 0 mg mL， an d the i mmo b i l i z a t i on t i me f or 1 0 h I n a d d i ti on ， t h e c h a r a c t e r i s ti c s o f f r e e a nd i mmo bi l i z e d na r i n gi n a s e we r e f ur t h e r i n ve s ti g a t e d Th e o p ti ma l p H v a l u e a n d t e mp e r a tur e o f i mmo b i l i z e d e n z y me we r e n o t c h a n g e d ， b u t a b e t t e r the r mal s t a b i l i t y a n d s t o r a g e s t a b i l i ty we r e o b s e r v e d f o r i mmo b i l i z ed o n e I mmo b i l i z e d n a r i n g i n ase c o u l d b e r e c y c l e d s i x ti me s to h y d r o l y z e n a r i n g i n an d s t i l l r e t a i n ed mo r e tha n 6 0 a c t i v i ty Ke y wo r ds ：p o l y v i n y l a l c o h o l( P VA) ；c a l c i u m a l g i n a t e ；i mmo b i l i z e ；n a r i n g i n a s e 中图分类 号：T S 2 0 1 2 5 文献标识码：A 文章编号 ：1 0 0 2 6 6 3 0 ( 2 0 1 1 ) 0 3 0 1 3 8 0 6 生物工程作为新技术革命的前沿发展领域 ，将在人 类社会的可持续发展中发挥 蕈要作用，而酶的固定化及 酶促反应是最具发展前景的生物技术工程。固定化酶 技术除具有酶催化反应特性外 ，还能在一定程度上解决 酶稳定性和重复利用等 问题 ，可适应工业化批量生产的 要求 。作为生物催化剂 ，固定化酶 已被 泛应用于化 学、制药 以及食品工业 ，因而固定化酶载体的开发和 利用显得尤为重要I 2 _ 。聚 乙烯醇( P V A) 是一种新型 的固 定化 载体 ，具 有机 械 强度 高 、稳 定性 好 、价 格低 廉 等优 点 ，但 由于其具有极 强的附聚性，使得其凝胶在 制 备凝胶珠体时 比较 困难 ，不易成犁 。另一种被广泛 应 用 的固定化酶载 体海藻酸钙凝胶 含水率高 ，成 形简单容易 ，但其 网络 的孔隙尺寸太大且凝胶珠机械 强度 较差，重复使用率不 高 。如果将两者进行优势互 补 ，采用复合法制备凝胶 ，则复合凝胶能满足优质固 定化载体 的要求 。 柚苷酶( E C 3 2 1 4 0 ) 具有 一 L 一 鼠李糖苷酶和 一 D一 葡萄 糖苷酶的活性，是一种胞外酶 ，在 p H2 5 6 0具有实 用活性 ，4 0 以下活性较高【 4 】 。用于生产柚苷酶的真菌 主要为曲霉属和青霉属 。2 0 0 0 年 ，Z v e r l o v等【 s 1 将编码 一L 鼠李糖苷酶的基因进行克隆并 导入埃希氏大肠杆菌 ( E s c h e r i c h i a c o l i ) 中，该基 因在埃希氏大肠杆菌中成功 的进行 了表达 。重组 技术使得柚苷 酶更易获得且更经 济 ，在食 品工业和制 药工业将获得 更大的用途 。柚 苷 酶中的 L 一 鼠李糖苷酶能将柑橘汁中的苦味物质柚 皮苷 水解为 鼠李糖和普鲁宁( 苦味约为柚皮苷 的三分之 一 ) ，而普鲁宁在 一 D 一 葡萄糖苷酶的作用下能被水解成 柚皮素( 无苦味) 和葡萄糖 。国外已有一些报道将柚苷酶 固定在不同的载体上后应用于柑橘汁的脱苦 f6 _s 和增加葡 萄酒 的风味 9 ，并取得了定的效果。我国对柚苷酶的 收稿 期 ：2 0 1 0 0 9 2 0 作者简介：雷生姣( 1 9 7 5-) ，女，博十研究生，研究方向为粮食、油脂与植物蛋白工程。E ma i l ：l e i s h e n g j i a o 1 6 3 c o m $通信作者 ：潘 思轶( 1 9 6 4-) ，男 ，教授 ，博士，研究方向为食品科学。E ma i l ：p a n s i y i ma i l h z a u e d u c n 生物工程 食 品 科 学 2 0 1 1 ， V o 1 3 2 ， N o 0 3 1 3 9 研究起 步较晚 ，且主要集 中在对柚苷酶产生菌的选育与 筛选上 1 o 1 2 ，对其在食品5 2 , 1 k 中的应用研究较少，对其 固定化 的研 究处于起 步阶段 。 本实验以聚乙烯醇和海藻酸钙为载体，戊二醛为交 联剂 ，采用延 时包埋 法【 1 引，制备性质稳定 的固定化柚 苷 酶聚乙烯醇凝珠 。针对 该载 体的结构特 点 ，对 固定 化酶载体制备条件 的优化进行考察 ，同时对 固定化酶与 游离酶的性质进行 比较研究 ，为固定化柚苷 酶的： 业化 应用 提供 参考 。 1 材 料 与 方法 1 1 材料与试剂 柚苷酶( C AS号：9 0 6 8 3 1 9 ) 、柚皮苷( HLP C 9 8 ) 美国S i g ma Al d r i c h公司；聚 乙烯醇( ( 1 7 5 0 5 0 ) u ) 、一 缩二乙二醇( DEG) ( 化学纯) 国药集 团化学试剂有限公 司；海藻酸钠( 化学纯) 上海化学试剂分装厂 。 1 2 仪器与设备 S 一 3 0 0 0 N型扫描 电镜 日本 Hi t a c h i 公司；uV一 7 5 0 4 型紫外 一 可见分光光度 计 上海光谱仪器有 限 司 ； 4 1 0 A型 p H计 美国 T h e r mo O r i o n公司；HHS 一 型恒温 水浴锅 国华 电器有限公司；恒温振荡器 金坛市杰瑞 尔 电器有 限公 一 J 。 l - 3 方法 1 3 1 柚苷酶活力的测定 游离酶活力测定 ：5 mL具塞试管中加入 0 6 mL底 物柚皮苷( 5 o o g mL ) H 0 3 mL醋酸缓冲液( 0 2 mo l L， p H4 0 ) ，在 6 0的恒温水浴锅中保温 5 mi n后立即加入 0 1 mL柚苷酶液( 2 0 mg mL) ，置入 6 0的恒温振荡器 ( 1 5 0 r ra i n ) 中准确反应 3 0 m i n ；取出反应液，添加 4 m L蒸 馏水和 4 9 mL体秋分数 9 0 的一缩二乙二醇 ( DE G) ，4 0 恒温水浴锅 中预热 3 5 mi n，再加入 4 O mo l L Na OH 0 1 mL，充分摇匀，在水浴锅中保温发色 1 0 mi n；取出 注入 l c m 比色皿内，用紫外分光光度计在 4 2 0 n m波长处 测定吸光度 ，通过柚皮苷标准 曲线计算酶活力。 以0 2 5 0 g t g mL柚皮苷为标准溶液，测定4 2 0 n m波长时的吸 光度 ，制作标准 曲线。同时以 0 1 mL醋酸缓冲液代替酶 液 作对 照 ， 以缓冲 液作 空 白。 固定化酶活力测定 ：方法与游 离酶活力测定基本相 同，只需将酶液用 1 g固定化酶凝珠代替 ，将 0 3 mL缓 冲液添加至 0 4 mL即可，其他均相 同。 酶活力定义( u) ：在测定条件下( 6 0 C，p H 4 0 ) ，每 分钟消耗 1 u g柚皮苷所需的酶量为一个酶活力单位。 游离酶或固定化酶相对活力是指在同组实验中以活 力最高的为 1 0 0 ，与其余的游离酶或固定化酶 的活力之 比 ， 以百 分 数表 示 。 1 3 -2 固定化酶凝胶颗粒的制备 按 9 0 g 1 0 0 m L的P VA和 1 0 g l O O mL的海藻酸钠比例 配制 1 0 0 g载体溶液 ，待溶液完全冷却后 ，加入 体积分 数 2 0 的戊二醛 ，充分混匀 ，置室温下交联 3 h。在 延时交联后的载体 中加入 1 0