S，S-氰戊菊酯间接竞争酶联免疫吸附分析方法研究.pdf

第40卷
分析化学( FENXI HUAXUE)研究报告
第4期
2012年4月
Chinese Journal of Analytical Chemistry
579~583
DO1:10.3724/SP.J.1096.2012.10569
S,S氰戊菊酯间接竟争晦联免疫吸附分析方法研究
张斌王鸣华
(南京农业大学植物保护学院,江苏佾农药学重点实验室,农作物生物灾害综合治理教育重点实验室,南京210095)
摘要合成了S,S氰戍菊酯的半抗原S-2-(4-氯萃基)-3甲基丁酸-aS(N-丁酸基)-甲酰氨-(3-萃氧基)苄酯
(EGb)。半抗原通过混合酸酐法与卵清蛋白(OWA)偶联作为包被抗原,活泼酯法与牛血清蛋白(BSA)偶联作为
免疫抗原。用免疫抗原免疫新西兰大白免,得到抗S,S氧戊菊酯多克隆抗体。通过异源分析及检测条件优化,
确立了间接竟争酶联免疫分析方法的最佳检测条件为pH7.4,0.4 MOLL Na+、40%甲醇-PBS溶液,建立了
,S氰戊菊酯酶联免疫分析方法。方法的抑制中浓度(ICo)值为(3.16±0.01)mgL;检出限(ICo)为(0.0053士
0.0012)mgL。对甲氰菊酯、溴氰菊酯、氯領菊酯、三氟氯菊酯及其代谢物戊菊酸没有明显交叉反应。在自来
水、河水和土壤样品中添加S,S竄成菊酯,其回收率分别为82.3%~108.2%,83.1%~109.2%和72.0%6~91.2%。
关键词S,S氰菊酯;半抗原;酶联免疫吸附分析
S,>氯戍菊酯( Esfenvalerate)是氰菊酯的4种立体异构体中活性最高的一种叫,生物活性约为氯
戊菊酯的4倍。S,S氰戊菊酯对哺乳动物低毒,但对水生生物高誹剛,其广泛应用于农业生产,进入水
环境的途径也日益增多。因此,建立简单快速的检测方法非常必要。我国对S,S氰戊菊酯的残留检测
以气相色谱法为主,此方法需要精密仪器,不适合大批量样品的快速测定。酶联免疫分析方法成本
低、速度快,适合大批量样品的快速分析,可为S,>氯戊菊酯的残留检测和监控提供极大的便利。
目前,对立体异构体的免疫分析研究很少,Shan等将3[4-(3-甲酰苯氧基)苯基]丙酸苄酯与S-戊
菊酸联接,通过酯水解制得半抗原。此方法保留了菊酸部分的一个手性位点·所得的抗体对S,S氧戊
菊酯有较高灵敏度。本研究用S,S氰成菊酯直接水解接臂,制得半抗原,保留了S,>氰戍菊酯的两个
手性位点,通过免疫新西兰大白兔获得特异性抗体,经过异源分析及检测条件优化,建立了S,S氰戊菊
酯酶联免疫分析方法。此抗体对S,氯戊菊酯立体识别特异性强。在自来水、河水和土壤样品中添加
回收率和相对标准偏差均符合农药残留分析要求,可用于水样和土壤样品中S,S氰戊菊酯的测定
2实验部分
2.1仪器与试剂
HT-5多功能搅拌器(江苏荣华仪器有限公司);R-200旋转蒸发仪(瑞士BCHI公司);DU800核酸
蛋白分析仪(美国 Beckman公司); LC-MSODE液质联用仪(美国 Finnigan公司);DRX500核磁共振仪
(美国 Bruker公司); Avant T26XP高速冷冻离心机(美国 Beckman公司); Professional Meter-50型pH计
(德国 Sartorius公司); Wellwash Plus型洗板机(美国 Thermo公司); imark酶标仪(美国 Bio-rad公司)
S,S氰戊菊酯(江苏皇马农化有限公司);氰成菊酯(南京红太阳股份有限公司);S戊菊酸及R戊菊
酸(江苏科达化工有限公司);4-氨基丁酸(国药集团化学试剂有限公司);牛血清蛋白(BSA)、卵清蛋白
(OA,上海索菜宝生物科技有限公司);山羊抗兔 IGG-HRP(美国 Sigma公司);邻苯二胺(OPD)及吐温-20
(Teen-20)( Sigma公司),其它试剂为分析纯。半抗原甲氰菊酯氯基水解产物(Fpa)、溴氰菊酯氰基水解产
物(Da)和三氟氯氰菊酯氰基水解产物(Cya),合成方法参考文献[7]。磷酸盐缓冲液(PBS,0.01mol/L,
pH7.4)、碳酸盐缓冲液(CBS,0.05moML,pH9.6)、含0.05%吐温-20的PBS溶液(PBST)。实验动物:雄性
011-06-02收稿;2011-0921接受
本文系江苏高校优势学科建设工程资助项目
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分析化学
第40卷
新西兰大白兔
2.2实验方法
2.2.1半抗原的合成合成路线如图解1所示。取5.9g(14mmol)S,S氰成菊和3mL水于
150mL三口瓶中,缓慢滴加8mL浓HSO2,于90℃回流搅拌反应50min。加入10mL水,用乙醚萃取两
次,有机相减压浓缩,得深黄色油状物。薄层层析纯化,展开剂为乙酸乙酯石油醚乙酸(30:70:5,V/V),
R,=0.51的组分用丙酮洗脱浓缩,得黄色的油状物S-2(4氯苯基)-3甲基丁酸aS羧基3苯氧基苄酯
( Efva),产率约为30%
称取2.0g(4.5mmol) Efva于100mL三口烧瓶中,加入5mL氯化亚佩,在79℃回流境拌反应2.5h。
减压浓缩,得黄色油状液体,加入15mL无水四氢呋喃溶解,于4℃下贮存备用。
称取0.3g(2.98mmol)4氨基丁酸于100mL平底烧瓶中,加人2mL2 mol/L NAOH溶液,在冰浴中
搅拌20min后,加入0.02g四丁基溴化铵。搅拌下滴加酰氯的四氢呋喃溶液,同时测定体系pH值,滴
加NaOH溶液保证反应液pH>8。在冰浴中继续搅拌反应4h。用浓HCl调至pH2,0,2×30mL乙酸乙
酯萃取,2×10mL水洗,无水Na2SO,干燥,减压浓缩,得到黄色的油状物。薄层层析纯化。展开剂为乙
酸乙酯石油醚-乙酸(28:67:5,V/V),R1=0.36组分用丙洗脱浓缩,得黄色油状产物S-2(4-氯苯基)
3-甲基丁酸-Q-S(N-丁酸基)-甲酰氨-(3苯氧基)苄酯(Efvb),产率约为25%。
THF,NaOH,冰浴 ice bath C]
CONH(CH) COOH
Efvb
?解1S,S氧戊菊酯半抗原的合成路线
Scheme 1 Synthesis scheme of haptens for esfenvalerate
2.2人工抗原的制备与偶联比的测定采用混合酸酐法将半抗原与卵清蛋白(OVA)偶联制得包被
抗原,采用活泼酯法将半抗原Efvb与牛血清蛋白(BSA)偶联制得免疫抗原劇。反应结束后,将反应液
置于PBS溶液中,在4℃下透析3d,每天换液3次。透析物于-20℃保存。
根据蛋白、半抗原和偶联物在紫外扫描图下吸收光谱的变化判断偶联是否成功,按文献[9的方法
计算偶联比。
2.2.3抗体的制备和纯化人工抗原按常量法川免疫健康新西兰大白兔,分离抗血清,辛酸-硫酸铵
法纯化抗体叫。冷冻干燥,制得冻干粉
2.2.4抗体效价測定及工作浓度选择采用间接非竞争酶联免疫分析法测定冻干粉效价。方阵滴
定法确定包被抗原和抗体的最佳工作浓度。选择包被抗原4mgL,OD4≈1.0时的冻干粉稀释倍数
为抗体效价。选择OD9值最接近1.0时的抗原抗体的浓度为抗原抗体的最佳工作浓度
2.2.5间接竞争酶联免疫分析(ic- ELISA)采用间接竞争酶联免疫分析法。用CBS缓冲液将包被
抗原稀释成相应最佳工作浓度后,包被在96孔酶标板上,100uL孔,4℃过夜。经PBST洗涤3次(下
同),加入1%OVA的PBS封闭液,200L孔,37℃下温育0.5h。洗涤3次,加入系