枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶发酵条件优化.pdf

食品与发酵工业「 FOOD AND FERMENTATION INDUSTRIES
DO1:10.13995/j.cnki.1l-1802/ts.201605018
枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶发酵条件优化
李洪康,李由然,李赢,顾正华,丁重阳,石贵阳,张梁
江南大学,粮食发酵工艺与技术国家工程实验室,江苏无锡,214122)
摘要对1株枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶发醇培养基以及发酵条件进行了优化,最终确定了摇瓶最佳发酵培
养基为:甘油40g/L、豆粕粉30g/L、麸皮10g/L、Na2HPO4g/L、K2HPO20.3g/L。摇床最佳发醉条件为:温度
30℃、转速250r/min、接种量体积分数6%,在此发酵条件下,酶活达到6082.7U/mL,发酵强度为56U/(mL
h)。在15L.发酵罐进行了初步验证,通过流加甘油分批发囀,在第25h晦活达到最大值,为11871U/mL。
关键词中性蛋白酶;枯草芽孢杆薗;发酵优化
根据作用的最适pH值,蛋白酶可分为酸性、中
枯草芽孢杆菌由本实验室前期保藏。
性和碱性蛋白酶3种。中性蛋白酶被最早发现并用1.1.2培养基
于生产领域,它普遍存在于细菌和真菌中,在pH7
(1)种子培养基(LB培养基,g/IL):蛋白胨10,酵
8时活性最大,在食品制作、酿酒、皮革生产、洗涤母粉5,NaCl10;
产品等领域广泛使用。目前高产菌株主要通过自然
(2)固体平板培养基(g/L):蛋白陈4,酵母粉
界筛选、人工诱变和分子生物学改造获得2?,国内2.5,琼脂18,脱脂奶粉12;
常用的中性蛋白酶生产菌主要为枯草芽孢杆菌
(3)发酵培养基(g/L):玉米粉40,豆粕粉30,麩
1398、栖土曲霉3942、放线菌166,粗酶液酶活在5皮30,Na2HPO4,K2HPO-0.3
000~-12000U/mL?时培养基成分及发酵条件对蛋1.1.3仪器与设备
白酹生产的影响非常大。蛋白酶是诱导酶,能够用有
15L全自动机械搅拌式发酵罐,浙江新昌得力石
机氮源来诱导酶的产生,但也会受到易利用氮源的阻化设备有限公司;多功能摇床,太仓强乐实验设备公
遏。细菌来源的中性蛋白酶按其催化机制属于金司;台式高速离心机, Eppendorf公可;HH-2型数显恒
属蛋白酶,无机盐的浓度对产酶会有很大影响。温水浴锅,金坛荣华仪器公司;V-1200分光光度计
另外在培养基中添加氨基酸也能有效地提高酶上海美谱达仪器公司等。
活·-,在发酵过程中,合适的通风量、变温发酵也1.2培养方法
会増加酶活2-1。本实验室保藏了1株枯草芽孢杆1.2.1种活化与发酵培养方法
菌,对其产酸性、中性及碱性蛋白酶能力及酶学性质
由甘油管取100以L菌液,接种于250mL摇瓶种
初步实验后。发现,其具有高产中性蛋白酶潜力。本子培养基中(装液量50mL),30℃、200r/min下活
研究从发酵培养基及发酵过程入手,对其进行发酵条化12h。转接于固体平板培养基上,在30℃培养箱
件的优化,以降低材料成本,简化工艺,为后续放大实倒置培养24h,挑单落转接于500mL摇瓶种子培
验及商业生产提供帮助。
养基中(装液量100mL),30℃、200r/min下培养12
h(OD。o值约为6)。将活化后的菌液按3%体积分数
材料与方法
接种到500mL摇瓶种子培养基中(装液量100mL),
1材料与试剂
于30℃、200r/min发酵培养,每12h取样测量中性
.1.1生产茵株
蛋白酶活力,每批次做3次平行实验。
15L发酵罐培养:将活化后的菌液按5%体积分
第一作者:硕土研究生(张梁教授为通讯作者,E-mail: zhang
数接种到15L发酵罐(装液量6L)。培养条件:温度
jiangnan.edu.cn)。
基金项目:国家高技术研究发展计划(863计划)项目30℃,pH自然,搅拌转速偶联控制溶氧浓度(DO)为
(2011AA100905)
30%,转速200~700r/min,通气量1.0vwm。
收稿日期:2015-12-28,改日期:2016-02-12
1.2.2中性蛋白酶酶活与发酵强度测量方法
102 2016 Vol 42 No,5(Total 3.
万方数据
生产与科研经验
按照国家标准GB/T2327~2009,采用福林法
酶活
400r发酵强度
测定。中性蛋白酶活力用蛋白酶活力单位表示,
定义为1mL液体酶在40℃和pH7.5条件下,1min
300
水解陷蛋白产生1g酪氨酸,即为1个酶活力单位,
2000
以U/mL表示。发酵强度定义为单位时间(h)、单位
盤
发酵体积(mL)生产的中性蛋白酶,即蛋白酶酶活与
发酵时间的比值,以U/(mL?h)表示。
答的小
1.2.3摇瓶发酵培养基对产酶的影响
碳源种
考察不同碳源(玉米粉、可溶性淀粉、糊精、蔗
糖、甘油、麸皮、葡萄糖、乳糖、麦芽糖)、氮源(豆粕
图1不同碳源对产酶的影响
Fig 1 Effect of different carbon sources on neutral protease
粉、尿素、NaNO3(NH4)2S0,、酵母粉、胰蛋白胨、蛋
白胨、鱼粉蛋白胨、玉米浆、棉籽粉)和无机盐(Zn
sO,、MgS0,CaCl2、CuS0,MaC2、FeC1,:6H2O、Fe:强度减弱,所以选用甘油为最优碳源。
S03、NaCl)种类对产酶的影响,考察甘油质量浓度
1000连活
「xw发酵强度
(20、30、40、50、60g/L)、豆粕粉质量浓度(10、20、30、
一3O
40、50g/L)对产酶的影响
1.2.4培养基正交实验设计
以甘油为最佳碳源,以豆粕粉为最佳氮源,以麩
10
皮作为生长因子,设计考虑交互作用的3因素2水平
正交实验
的,“绣
1.2.5摇巍发酵培养条件对产酶的影响
复合碳源种类
考察不同温度(25、27、30、3、37、40℃)、接种量
(3%、4%、5%、6%、7%,体积分数)、转速(150、180
图2复合碳源对产酶的影响
Fig 2 Effect of different composite carbon sources
200、230、250r/min)对产酶的影响
on neutral protease activ
1.2.615L发酵罐发酵验证
将摇瓶培养基和培养条件的优化结果在15L发2.2甘油浓度对产酶的影响
酵罐上验证,并利用甘油、糊精进行流加分批发酵。
选取甘油为最优碳源,考察不同碳源浓度对产酶
的影响,将甘油质量浓度分別设为20、30、40、50和
2结果与分析
60g/L,其他成分为豆粕粉30g/L, Na, HPO4g/L,K2
2.1不同碳源对产酶的影响
HPO20.3g/L,结果如图3所示
将发酵培养基中的40g/L玉米粉分别用40g/L
海活
文强度
溶性淀粉、糊精、蔗糖、甘油、麩皮、葡萄糖、乳糖、麦
芽糖替换。其他成分为豆粕粉30g/L,Na2HPO2-4g/
L,K2HPO20.3g/L。于30℃、200r/min培养,每12h
2000
巡

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