GBT 19438.1-2004 禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法.pdf

GB/T19438.1-~2004
前言
GB/T19438~2004《禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》分为以下四个部分:
ーー-GB/T19438.1--2004《禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法》
GB/T19438.2-2004《H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》
GB/T19438.3--2004《H7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》;
GB/T19438.4~-2004《H9亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》。
本部分的附录A、附录C是规范性附录,附录B是资料性附录。
本部分由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出。
本部分起草单位:中华人民共和国北京出人境检验检疫局、深圳市匹基生物工程股份有限公司。
本部分主要起草人:赖平安、张晓、谷强、王甲正、周琦、杨伟、赖少梅。
GB/T19438.1-2004
禽流感病毒通用荧光
RT-PCR检测方法
范围
本部分规定了禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测的操作方法。
本部分适用于活禽及其产品中禽流感病毒的检测
缩略语
下列缩略语适用于本部分
荧光RT-PCR
芠光反转录聚合酶链反应
Ct值
每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。
RNA
核糖核酸
DEPC
焦碳酸乙二酯
PBS
磷酸盐缓冲盐水(配方见时录A)
Taq酶
Taq DNA聚合酶。
3原理
禽流感病毒各亚型均属A型流感病毒,根据A型流感病毒共有基因特定的序列,合成一对特异性
引物和一条特异性的荧光双标记探针。该探针与禽流感病毒特有的共同基因特异性结合,结合部位位
于引物结合区域内。探针的3'端和3'端分别标记不同的荧光素,如5'端标记FAM荧光素,它发出的荧
光能够被检测仪器接收,称为报告荧光基团(用R表示),3'端一般标记 TAMRA荧光素,它在近距离内
能吸收5'端报告荧光基团发出的荧光信号,称为淬灭荧光基团(用Q表示)。
当PCR反应在退火阶段时,一对引物和一条探针同时与目的基因片段结合,此时探针上R基团发
出的荧光信号被Q基团所吸收,仪器检测不到R所发出的荧光信号;当PCR反应进行到延伸阶段时
Taq酶在引物的引导下,以四种核苷酸为底物,根据碱基配对的原则,沿着模板链合成新链;当链的延伸
进行到探针结合部位时,受到探针的阻碍而无法继续,此时的Taq酶发挥它的5'→3'外切核酸悔的功
能,将探针水解成单核苷酸,消除阻碍,与此同时标记在探针上的R基团游离出来,R所发出的荧光再
GB/T19438.1--2004
不为Q所吸收而被检测仪所接收;在Taq酶的作用下继续延伸过程合成完整的新链,R和Q基团均游
离于溶液中,仪器可继续检测到R所发出的荧光信号。
4材料与试剂
4.1仪器与器材
4.1.1荧光RT-PCR检测仪。
4.1.2高速台式冷冻离心机(离心速度12000r/min以上)。
4.1.3台式离心机(离心速度3000r/min)。
4.1.4混匀器。
4.1.5冰箱(2℃~8℃和一20℃两种)。
4.1.6微量可调移液器(10PL、100pL、1000axI)及配套带滤芯吸头
4.1.7 Eppendorf管(1.5mL)。
4.2试剂
除特别说明以外,本标准所用试剂均为分析纯,所有试剂均用无RNA酶污染的容器(用DEPC水
处理后高压灭菌)分装。
4.2.1三氯甲烷。
4.2.2异丙醇:-20℃预冷。
4.2.3PHS:121℃士2C,15min高压灭菌冷却后,无菌条件下加入青霉素、链霉素各10000IU/mL。
4.2.475%乙醇:用新开启的无水乙醇和DEPC水配制,一20℃预冷。
4.2.5禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测试剂盒:组成、功能及使用注意事项参见附录B
5抽样
5.1采样工具
下列采样工具必须经121℃±2℃,15min高压灭菌并烘于:
一棉拭子;
剪刀,镊子
注射器;
ml. Eppendorf管
研钵
样品釆集
5.2.1活禽
取咽喉拭子和泄殖腔拭子,采集方法如下
取咽喉拭子时将拭子深入喉头口及上颚裂来回利3次~5次取啾喉分泌液
取泄殖腔拭子时将拭子深入泄殖腔转一圈并沾取少量粪便
一将拭子一并放入盛有1.0ml.PBS的1.5m[. Eppendorf管中,加盖、编号。
5.2.2肌肉或组织脏器
待检样品装人一次性塑料袋或其他灭菌容器,编号,送实验室。
5.2.3血清、血浆
用无菌注射器直接吸取至无菌 Eppendorf管中,编号备用
5.3样品贮运
样品采集后,放入密闭的塑料袋内(一个采样点的样品,放…个塑料袋),于保温箱中加冰、密封,送
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有相同的效果,则可使用这些等效产品。