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广西大学
博士学位论文
微生物利用甘蔗糖蜜发酵产多不饱和脂肪酸的研究
姓名:李煵
申请学位级别:博士
专业:微生物学
指导教师:梁智群
20071130
微生物利用甘蔗糖蜜茇酵产多不饱和脂肪酸的研究
摘要
多不饱和脂肪酸( Polyunsaturated fatty acids, PUFAS)是指含两个或两
个以上双键且碳原子数为16-22的直链脂肪酸,主要有亚油酸( Linoleic acid,
LA)、γ亚麻酸(γ Linolenic acid,GLA)、花生四烯酸( Arachidonic acid,
ARA)、0-亚麻油(a- Linolenic acid,ALA)、廿碳五烯酸( Eicosapentaenoic acid,
EPA)和廿二碳六烯酸( Docosahexaenoic acid,DHA)等。多不饱和脂肪酸大
多数是生物活性物质的前体,尤其是对智力发育、心血管病等有良好效果
此外 PUEAS还可用作食品添加剂、营养配方、健康辅料以及保健品等。微生
物所具有的营养简单、生长繁殖快、易变异、可工业化大规模培养的优点
决定了利用微生物生产油脂是一条开发新油源的良好途径。目前国内外研
究通常利用葡萄糖、淀粉和蔗糖等作为碳源生产多不饱和脂肪酸。作者试
图从土壤中筛选出以甘蔗糖蜜为碳源,发酵生产多不饱和脂肪酸的菌株,
并对菌株进行诱变育种,发酵条件,代谢调控,油脂的分离提取和富集等
方面进行研究,以及利用气相色谱进行油脂组成和含量鉴定分析。本研究
的结果如下
1、利用苏丹黑B染色和测定多不饱和脂肪酸碘值的方法,从土壤中筛
选出一株适合用甘蔗糖蜜为原料生产多不饱和脂肪酸的霉菌LB1。对LB1菌
株进行形态特征、生理特征分析及5.8 S RDNA基因两侧的内转录间隙进行序
列分析推断该菌株为反屈毛霉属( Mucor recurwus)
2、以土壤筛选到的反屈毛霉LB1为出发菌株,通过Co辐射复合LiCI
诱变,进行富含多不饱和脂肪酸菌株的选育。菌种的筛选主要以含脂量以
及碘值的高低作为选择茵株的依据,筛选到一株不饱和脂肪酸高产菌株
MR-10,较原始菌株总脂含量増加35.42%,碘值增加36.56%, PUFAS増加
43.76%。将筛选出的菌株分别进行遗传稳定性测试表明,菌株经过五次转
代培养,具有较好的遗传稳定性。
3、在反屈毛霉LB1发酵条件优化的实验中,探讨了不同碳源:葡萄糖、
蔗糖、淀粉以及PDA等对发酵的影响。从结果和糖蜜的成分分析以及经济
角度考虑,糖蜜可以作为发酵生产多不饱和脂肪酸的碳源,且糖蜜的最佳
浓度为15%。同时确定尿素为最佳氮源,最佳CN比为35/1。通过单因子试
验和正交实验,得到发酵生产不饱和脂肪酸的最佳培养条件为:培养温度
25℃,摇床转速160rpm,培养时间5天。在上述条件下,反屈毛霉LB1发酵
可得生物量、总脂量和 PUFASI产量分别达到12.51gL,7.13gL和5.74gL。
4、在反屈毛霉LB1发酵代谢调控中,在发酵过程中补加十八醇、十六
醇和正丁醇前体物,得出补加十六醇可以提高菌丝的油脂和不饱和脂肪酸
含量。在发酵24小时后补加1.5%的十六醇,可获得最大的油脂含量8.24gL:
碘值113.84, PUFAS6.96gL。
培养基中添加适量浓度金属离子Mg*可以提高菌丝多不饱和脂肪酸的
产量,当MgSO4在20-30moL范围内,生物量、油脂含量、碘值及 PUFAS
随MgSO的増加而増加。当Mg“浓度为30 mmol/L时,油脂含量6.62gL
碘值109.10, PUFAS.16gL。高于30 mmol/LI时,生物量、油脂含量、碘值
及 PUFAS.有所下降,说明高浓度的金属离子对发酵生产有抑制作用。
在培养中添加适量的维生素可以提高油脂中 PUFASE的含量,但对生物量
影响不大。维生素B1和维生素B作为油脂生物合成过程中合成酶的辅助因
子,在不饱和脂肪酸的形成起到重要作用。维生素的添加量也有一定的影
响,随添加维生素浓度的增加,油脂的碘值和 PUFAS1有所増加,维生素B1
添加量为0.20mg/mL较为合适,而维生素B。0.25mg/mL为适宜,说明高浓
度维生素对不饱和脂肪酸的积累有利。
代谢调控中低温老化是増加不饱和脂肪酸产量的一种有效方法,反屈
毛霉LB1在5℃储存15天后,油脂含量由5天的5.18gL到5.72gL, PUFAS
由3.37gL到4.60gL。利用低温和老化的共同作用可以提高不饱和脂肪酸
的含量
5、在石油醚萃取,正己烷萃取和盐酸水解乙醚抽提等三种油脂分离提
取方法中,采用盐酸水解乙醚抽提方法为本研究油脂提取方法,多不饱和
脂肪酸富集部分采用尿素包合冷冻结晶法进行。研究表明当混合酸:乙醇
尿素=1:1.5:7.5时,富集效果最佳。在此条件下富集,微生物油脂中的
碘值从原来的91,20提高到102.45,油脂的不饱和度提高了12.35%。
采用菌体直接进行油脂的甲酯化方法,通过气相色谱分析油脂和不
饱和脂肪酸的组成和含量。通过样品和标品气相色谱出峰及保留时间的对
照,利用面积归一化计算,得出菌株的油脂含量为7.13g兀L,不饱和脂肪酸
含量达到5.74gL。其中油脂中多不饱和脂肪酸的组成及含量为:油酸885
mgL,亚油酸825mgL、Y-亚麻酸1352mgL、a-亚麻酸176mgL、花生
四烯酸567mgL、甘碳五烯酸467mgL、甘二碳六烯酸348mg/L。