脱壳病和吻肿病东风螺体内致病菌及条件致病菌菌相研究.pdf

第31卷第2期
海洋科学进展
Vol 31 No.2
2013年4月
ADVANCES IN MARINE SCIENCE
脱壳病和吻肿病东风螺体内
致病菌及条件致病茵菌相研究
李淑芳,邱德全2,张继东·,杨世平2,贾春红1,邱明生2
(1.ノ东海洋大学动物医学系,广东淇江524088;广东海洋大学水产学院,广东洪江524088)
摘要:为探讨东风塚脱壳病和匆肿病与体内外致病菌及条件致病甫劼祖关性,测定了东凤螺养殖水体环境中异
养贿硒落总数,并対病螺及從康内致病厲及条件致病蘭行了分离鉴定。经血塔养基、TCBS培养基和弧菌
显色培养基分离培养,刊玍化试验和细菌16 S DNA序列分析鉴定,结旻显示:发生脱売病的方斑东风螺螺池水体
中的异养菌茵落总数为1.34×10°cfu/mL,病螺体内分离的致病茝及条件致病菌有副溶血弧速、哈氏弧曹、河流
菌、 Vibrio heputarius、腐败希瓦氏菌、海藻希瓦氏菌和芽抱杆菌,共中先勢菌株为溶血性弧菌溶血菌株和哈弧
菌;脱壳病与吻肿病共患的泥螺螺池水体中异养菌的菌落总数为1,46×10cfu/mL.,病螺体内分离的致病菌及条
件致病菌有副溶血弧菌、哈氏瓢菌、鲍鱼希瓦氏菌、海藻希瓦氏菌和芽胞杆菌,优勢菌苯为海藻希瓦氏菌、鲍鱼希瓦
氏菌和哈氏弧菌;健康东风螺螟池水体异养菌菌蒋总数为7.6×10'cfu/mL-,健康东灰螺螺体内约优势菌味为副溶
血性菌非溶血菌和 Vibrio he patarius。试验结果表明,东风螺脱元病疝吻肿与养殖水体环境中异养菌的
数及螺体河部致病菌及条件致病菌分布具有一定相关性
关鍵词:东风螺;脱觅病;吻翀病;致病茵和条件致病菌:菌相:16 S RDNA序列
中图分类号:S94.4~9
文献标识码:A
文章编号:1671-6647(2013)02-0266-07
东风螺( Babylonia areolata)属软体动物腹足纲、蠍螺科、东风螺属。我国的主要养殖品种有方斑东风
螺( Babylonia areolata)、泥东风螺( Babylonia lutosa)和台湾东风螺( Babylonia formosae)三种。2000年以
米?东风螺在我国广东、海南、福建等南海地区已实现人工规模化养殖。目前,对东风螺规模化养殖危严重
的主要疾病为脱壳病和吻肿病。东风螺脱壳病在我国首次发生于8002年,且在2004年出现较大规模暴发
至今在东风螺养场时有发生,发病率可高达80%以上,具有传染性和复发性。为探讨尔风螺脱売病和
吻肿病与条件致病菌的相关性,从2011年斤始,本课题纽对广东省湛江市某大型东风螺规模化养殖场发病
螺池和未发病螺池的水样进行了异养菌菌落总数检测,并对脱?病和吻肿病病螺以及健螺进行了条件致
病菌的分离与鉴定,以期找出东风螺脱壳病、吻肿病与致病菌及条件致病菌感染的相关关系,为东风螺疾病
的病因学研究和防治技术研究提供科学依据
材料与方法
1.1试验材料
.1.1样品采集
2011年,湛江市某东风螺养殖场(循环水养殖),方斑东风螺发生脱壳病,同场养殖的泥东风螺发牛脱壳
收稿白期
资助项目:广东省海洋洎业局科技排广专项一一「厂化养殖、池塘、潮下线海区规模化养殖方斑东风蝶(A20110
作者简介:李淑芳(1964-),河北石家庄人,女,博士:,教授,从事动物微生物与免疫学方面研究.E-mail:lishufang816@126.com
通讯作者,E-mail:ZJDo305@126.com
王佳实编辑
万方数据
李淑芳,等:脱壳炳和昒肿病乐风螺体内致病鹵及条什致病菌菌相硏究
病和吻肿病混合感染。选择脱壳病方斑东风螺养殖池、脱壳病-吻舯病混合感染的泥东风螺养殖池和未发病
的方斑东风螺养殖池各1个,每池采集水样各20cm!。从脱壳病方斑东风螺池选取5只脱壳后健活的软体
螺,从脱壳病-吻肿病況令感染螺池选取5只吻跇病螺,从未发病方爼东风螺池选择临床健康螺5只,分别
放人盛有适量原池水的灭菌三角瓶备检
主要试剂与培养基
Mightyamp DNA Polymerase试剂盒及I) NA Marker,购自 Takara公司大连分公同;细菌16 SRDNA
签定通用引物,由上海英骏生物技术有限公司ア州分公司合成。科玛嘉弧菌显色培养基,购于上海科玛嘉微
生物技术有限公司;TCBS培养基,购自心东环凯微生物科技有限公司;弧菌科细菌生化鉴定管,购于浙江天
和微生物试剂有限公司:5%兔血琼脂平板,由本试验室白行制备
1.1.3主要仪器
PCR仪, Bionctra_ Ig PCR;DYY-8C型电泳仪,北京六一仪器厂;SPX-250B-7型生化培养箱,上海博迅
实业有限公司。
1.2试验方法
1.2.1水体异养菌落总数测定
采用常规平皿倾注计数法,测定发病池和未发病池内异养菌的菌落总数。培养温度35℃,培养时间48h。
条件致病菌的分离
将脱壳病病螺软体、带壳吻肿病病螺及健康螺样品用灭菌生理盘水冲洗,采用无菌钳砹碎螺壳,取出完
整软体,分别用灭菌生理盐水冲洗3遍后,用灭菌手术剪剪断螺的足部肌肉,将新鲜断而涂布接种于5%兔
血琼脂平板,并用灭菌接种环蘸取螺生煊腺内容物划线接种于另一兔血琼脂平板。35℃培养18~24b。
2.3TCBS培养基和科玛嘉孤菌显色培养基培养
从上述免血婛脂平板上挑选溶血和不溶血的单个菌落,每板挑选3~5个菌落,分别划线接种于3.5%
NaC营养脂培养基(pH6.8)进行纯化培养。然后,从营养琼脂平板上分别转接至TCBS培养基和科玛嘉
狐菌显色培养基35℃培养18~21h。根据细菌在不同培养基上的生长特性和菌落特征,初步判定细菌
种类。
1.2.416 S RDNA PCR扩增与序列分析
将上述试验分离得到的菌株,用其18h的新鲜培养菌落、进行16 S TINA PCR扩増与序列分析
2.4.1引物设计与合成
根据F.coli16 S RDNA基因序列保守区域设计两段引物(16SF:5'- ACA GTT TGA TCC TGG CTC
AGA ACG AAC GCT3;16SR:5- TAC GGC TAC CTT TT ACG ACT TCA CCC C-3'),山上.海英骏生
物技术有限公司广州分公司合成。
2.4.216SrI)NA扩增与琼脂糖凝胶电泳
将分离菌侏分别划线接种于3.5%NaC营养琼脂(pH7.8),35℃培养18h,用+16 S TINA扩增
根据 Takara公同产品 Mighty Amp DNA Poiytnerase Ver.2使用说明,用落PCR方法进行扩增
反应体系包括2× Mighty Amp buffer25rI-, Primer1和 Primer2各15pmol, Mighty: Amp DNA Polymer
j/pL),加ddl()至
PCR反应程序为:98℃预变性2min;98℃变性10s,55℃送火15s,68℃延伸90s,进行40个循环
68℃延伸90s;4℃保存。IPCR扩増产物进行1%琼脂糖凝胶电泳
16 S IDNA PCR产物测序
将16SrI)NA扩增反应体系与引物一同系送上海英骏生物技术有限公司广州分公司测序部测序
1.2.5生化反应试验
将分离菌株的新鮮固体培养物,分别接种于葡萄桾、蔗糖、阿拉伯糖、甘蕗糖、肌醇、VP试验、蛋白胨水、
万方数据