四级杆串联质谱分析苄嘧磺隆污染蟾蜍耳后腺中蟾蜍甾烯水平.pdf

第43卷
分析化学( FENXI HUAXUE)研究报告
第9期
2015年9月
Chinese Journal of Analytical Chemistry
1415~1
DOI:10.11895/j.isa:.0253-3820.150038
四级杆串联质谱分析苄嘧磺隆污染蟾蜍耳后腺中蟾蜍甾烯水平
周婧王洪兰马宏跃闫文丽龚艳钱琎段金廒吴启南
(南京中医药大学药学院,江苏省中药资源产业化协同创新中心,南京210023)
摘要研究了除草剂苄嘧磺隆皮肤接触污染对中华大蟾蜍分泌蟾酥化学品质的影响。蟾酥样品经甲醇提
取,以乙腈1%甲酸水溶液为流动相,液相色谱(反相C:柱)分离、串联质谱(LC-MS/MS)分析检测。质谱条
件为:MRM模式,脱溶剂温度500℃,碰撞电压30eV,锥孔电压为30V。结果表明,建立的LC-MS/MS测定方
法对6种蟾蜍甾烯标准物质的检出限为0.42~4.86ng/mL,相关系数R=0.9953~0.992,日内和日间RSD
为3.8%~6.8%和4.0%~8.8%;加样回收率为96.9%~109.6%,相对标准偏差为2.0%~8.1%。应用此
方法检测了36种蟾蜍甾烯化合物,有20余种化合物自身质谱积分面积在苄嘧磺隆污染前后发生改变,苄嘧
磺隆皮肤接触污染可以改变蟾蜍耳靥腺蟾蜍毒素的表达模式。本方法可应用于蟾蜍甾烯类物质检測。
关键词中药资源学;蟾蜍;苄嘧磺隆;蟾酥
引言
蟾酥为中华大蟾蜍 Bufo bufo gargarizans Cantor或黑眶蟾蜍B√ melanostictus Schneider耳后腺的干
燥分泌物。以往研究显示,蟾酥化学质量差异较大,2?,不同产地商品中蟾蜍甾烯类成分含量相差数倍
至数十倍。其原因除了遗传因素外,环境影响尤为重要。据调查,中药材蟾酥主要来自于野生蟾蜍,蟾
蜍皮肤具有通透性,对环境重金属、农药、生活(工业)污水敏感,是环境科学研究的前哨物种。污染
物能在蟾蜍体内蓄积和放大,但是污染物对蝰蜍耳后腺分泌物形成的影响研究甚少。
蟾酥主要含有强心苷类蟾蜍甾烯化合物,其含量测定方法大体可分为有LC-UV和LC-MS两类。MS在
蟾蜍甾烯定性鉴别和定量灵敏度方面均显著优于UV方法。已有学者采用QTOF和 Ltq-orbitrap对多种蟾
蜍甾烯的质谱二级裂解模式进行特征和含量分析3-?。在此基础上,本研究采用四级杆串联质对蟾酥中
36种蟾蜍甾烯进行检测,以质谱积分面积表示毎种蟾蜍甾烯化合物在不同样本组间的相对含量(化合物自身
比较),并结合数学模式识别方法,评估嘧磺隆污染前后蟾蜍分泌蟾酥化学性质的变化。
实验部分
2.1仪器与材料
Waters Xevo-TQ三重四极杆质谱仪,配备 Acquity UPLC系统(包括四元泵溶剂系统、在线脱气机和
自动进样器),同时配有 Waters Masslynx V4.1数据工作站(美国 Waters公司);低温超高速离心机(美
国 Thermo公司);离心浓缩仪、冷冻干燥仪( Labconco公司);EPED超纯水系统(南京易普达易科技发展
有限公司);电子分析天平(上海精密仪器厂);蟾蜍甾烯标准品 Cinobufotalin, Resibufagenin, Gamabufo-
talin, Hellebrigenin, Cinobufagin和 Bufotalin按文献[]报道方法分离制备,高效液相色谱鉴定纯度大于
95%;苄嘧磺隆(丁贝生物公司)。中华大蟾蜍(捕于南京周边)。
2.2苄嘧磺隆污染蟾蜍的分组与取样
中华大蟾蜍30只,产地为江苏省,均分成3组,组间个体无显著差异。配制苄嘧磺隆低剂量组
(0.15g/L),高剂量组(0.3g/L)及正常组(0g/L)。中华大蟾蜍饲养在含或不含苄嘧磺隆的水溶液中。
用分析天平称取苄嘧磺隆0.15和0.30g,加到1L盛有隔夜自来水的烧杯中,搅拌,使之充分溶解。待
蟾蜍取食完毕后,将上述配好的药液倒人蟾蜍培养箱中,培养2天后,倒掉培养箱中原液,把培养箱冲洗
2015-01415收稿;2015406-14接受
本文系国家自然科学青年基金(Nos.81102762,3901894,81274199),江苏省中药资源产业化过程协同创新中心基金(No.ZDXM-1-
14),江苏省六大人才高峰C类(No.YY015),江苏高校优势学科建设工程资助项目(N。.PAPD)资助
wE-mail:hongyuema(@126.com;qnwyjs@163.com
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分析化学
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干净,给蟾蜍喂食,待取食完毕后,加人药液,如此反复,培养半个月。抓取蟾蜍,称体重。用包裹胶布的镊
子挤压蟾蜍耳后腺,使蟾酥喷溅到载玻片上,将鲜酥刮至EP管中,冷冻干燥,记录冻干前后蟾酥的重量。
2.3供试品溶液的制备
将干燥后的蟾酥样本于硏鉢中研磨成粉末(未过筛),每个样本准确称取10mg,置于玻璃试管中,
分别准确加人5mL甲醇,保鲜膜封口,超声提取30min,冷却后经0.22μm滤膜过滤,作为供试品溶液。
2.4色谱/质谱条件
ACQUITY UPLC BEH CRT色谱柱(100mx2.1mm,1.7um);柱温35.0℃:流速0.4mL/min;进
样量5μL;流动相A为0.1%甲酸溶液,流动相B为乙腊;梯度洗脱程序:0~2min,20%~30%B;
2~6min,30%~35%B;6-9min,35%~60%B;9~10min,60%~95%B;10~1mnin,95%B;
11~11.20min:95%~20%B。
离子源为电喷雾离子源(FSI),正离子模式检测;质量扫描范围为MS':20-~1974Da,MS2:2
2048Da;扫描速率为M1:100~2000amu/s,M2:100~10000 amu/s;毛细管电压为3.00kV;锥孔电压为
30.00V;离子源温度为150℃;脱溶剂气体流速为99Lh;脱溶剂温度500℃。参照文献[8~15]总结
蟾蜍甾烯化合物的分子离子和子离子,经UPIC-MS/MS预测,选取36种化合物(表1),其响应较强、干
扰较小的两对子离子可用于定性分析,目标化合物检测离子对碰撞电压(CE)统一设置为30eV,可以满
足蟾酥生药中嶝蜍甾烯的测定。
表1蟾蜍甾烯化合物信息表
Table I Bufadienolides deteted by UPLC-MS/MS and multi-reactions monitoring(MRM) technology
化合物
保留时间
Relenti
MS
化合物
保留时间
Compound
time (min)
)(m/2)
Compounds
time(min)(m/a) (m/z
Resibufogenin
Dehydratedcinobufa
10.29425
28-hydroxylresibu
401
的56阳6粥
9-0x0-cinobufagln
401
128-hydroxylcinobufagin
Marinobufagin
Cinobufotalin
Gamabufotalin
403
19-oxo-cinobumotalin
19-hydroxylbufalin
2,81
Bufalin-3-succinate-arginine