NYT 772-2013 禽流感病毒RT-PCR检测方法.pdf

ICS11.220
B41
NY
中华人民共和国农业行业标准
NY/T772-2013
代替NY/T772~-2004
禽流感病毒RT-PCR检测方法
RT-PCR detection method for avian influenza viruses
2013-09-10发布
2014-01-01实施
中华人民共和国农业部发布
NY/T772-2013
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。
本标准代替NY/T772-2004《禽流感病毒RT-PCR试验方法》。
本标准与NY/T772-2004相比,主要变化如下:
将原标雅名称中“试验方法”改为“检测方法”;
一一将原标准中两套操作标准,合并成一套操作标准;
将原标准中异硫氰酸胍提取RNA方法,改用商品化RNA提取试剂提取方法;
ー一将原标准中RT-PCR检测模式,改为商品化一步法RT-PCR试剂盒的检测模式;
更新了检测H7亚型禽流感病毒的引物序列,新增通用型HA和NA基因全长的RT-PCR检
测方法;
更新了RT-PCR扩增产物与加样缓冲液进行混合的方法;
增设检迥流程,说明如何搭配使用此标准中含有的多对引物,实现不同的检测目的
本标准由中华人民共和国农业部兽医局提出。
本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。
本标准起草单位:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、中国动物卫生与流行病学中心
本标准主要起草人:王秀荣、刘朔、陈继明、蒋文明、包红梅、陈化兰
本标准所代替标准的历次版本发布情况为:
NY/T772-2004。
NY/T772-20
禽流感病毒RT-PCR检测方法
1范
本标准规定了禽流感病毒型特异性RT-PCR(反转录一聚合酶链式反应)检测技术(各亚型通用),
以及禽流感病毒H5、H7、H9血凝素(HA)亚型和N1、N2神经氨酸酶(NA)亚型的RT-DCR检测技
术
本标准适用于检测禽组织、分泌物、排泄物和禽胚尿囊液中禽流感病毒的核酸
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注口期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
(iB/T18936高致病性禽流感诊断技术
实验室条件
3.1仪器
PCR仪、台式低温高速离心机、电泳仪、电泳槽、冰箱、紫外凝胶成像仪、微量移液器和水浴箱等。
3.2操作区城
样品处理区要有相应的生物安全设施;RNA提取区和RT-PCR配液区要求高度洁净;电泳区要
其他操作区域相互隔离。
3.3操作者
操作者应接受过RT-PCR技术培训;熟悉防止RNA降解、核酸污染和溴化乙锭污染的具体措施
熟悉RT-PCR检测结果的判断方法。
4试荆的准备
4.1试剂
4.1.1商品化的RNA提取试剂盒。
4.1.2商品化的一步法RT-PCR试剂盒。
4.1.31.5%琼脂糖凝胶,见A,1
4.1.41×TAE缓冲液:见A.2
4.1.5溴化乙绽(10g/kL),见A
4.1.6核酸电泳加样缓冲液,见A.4。
4.1.7商品化的DNA分子量标准,要求在100bp~1000bp之间有5条以上的指示条带。
4.1.8用已知的含有与RT-PCR检测引物(附录B)相对应的且灭活的禽流惑病毒制作的阳性对照标
准品(来自商品化试剂盒或者省部级以上的实验室)
1.9用高压灭菌的蒸馏水作为阴性对照标准品。
4.2引物
序列见附录B,浓度均为10rmol/L,在RT-PCR反应体系的最终浓度是0.4mol/L。
NY/T772-2013
操作程序
5.1样品采集和处理
按照GB/T18936中提供的方法进行
5.2对照设置
每次检测每对引物,用相应的阳性对照标准品和阴性对照标准品,至少设置一个或一个以上的阴性
对照和样品对照
5.3RNA提取
按照RNA提取试剂盒的说明书,提取样品和对照的RNA。提取的RNA应随即进行检测,否则应
70℃冻存
5.4RNA扩増体系的配制
按照商品化的一步法 RT PCR试剂盒说明书,配制RT-PCR反应体系。例如,在RT?PCR管
中,依次加入 DEP(水13L、2× RT PCR緩冲液25L、RT-PCR酶混合物2gl、上下游引物(10
uDol/L)各2xL、待检测的RNA6pI-;如果同时进行多个样品的检测,可以按照上述比例,将待测的
RN以外的溶液混合在一起,然后每个RT-PCR管中分别加入4L此混合液,再加人6pL对应样
品的RNA。对于采用PCR管底部加热的PCR仪,每管加样后,需要再加PCR专用的20pl.石蜡油。
有时可以选择总体积为25L的RT-PCR反应体系
5.5RT-PCR反应
按一步法RT?PCR试剂盒操作说明,设置反应条件。通常,第一步是RT,AMV反转录酶最适反
应温度是42℃,MMLV反转录酶最适反应温度是37℃,还有?些反转录酶最适反应温度是50℃,反转
录时间为30min;第二步是灭活反转录嗨,95℃、3min;第三步是PCR。各对引物反应条件见附录B
5.6RT-PCR产物电泳
RT-PCR结東后,每个RT-PCR管加入5pL核酸电泳加样缓冲液,密闭RT-PCR管,充分混合,
再每管取5pL~10以L.加人琼脂糖凝胶板的加样孔中,在位于凝胶中央的孔加人DNA分子量标准。对
于加封石蜡油的RT-IPCR扩增产物,需要吸取RT-PCR产物,按比例加人核酸电泳加样绶冲液充分
混匀。加样后,按照每厘米凝胶5V电压,电泳20minー40min(每次电泳时,每隔10min观察一次。当
加样缓砷液中溴酚蓝电泳过半至凝胶下2/5处时,可停止电泳)。电泳后,置于紫外凝胶成像仪下观察
用分子量标准判断RT-PCR扩增产物大小。
5.7RT-PCR产物测序
RTP(R阳性扩増产物,用 Sanger方法进行序列测定
6结果判定
6.1阳性对照出现相应大小的扩增条带,几阴性对照无此扩増带时,判定检测有效;否则,判定检测结
果无效,不能进行下面的判断
6.2用附录B中的M-229或NP-330引物检测,电泳出现对应大小的扩増条带,判定为禽流感病毒
核酸阳性;否则,判定为禽流感病毒核酸阴性。
6.3用附录B中的H5·380或H5·545引物检测,电泳出现对应大小的扩增条带,判定为15亚型禽
流感病毒核酸阳性;否赙,判定为HS亚型禽流感病核酸阴性。
6.4用附录B中的H7263引物检测,电泳出现对应大小的扩增条带,判定为H7、111或15亚型
禽流感病毒核酸阳性(对扩增产物进行测序分析,可以确定是7亚型禽流感病彭核酸阳性,还是110
或115亚型禽流感病毒核酸阳性);否则,判定为H7亚型禽流感病毒核酸阴性。
6.5用附录B中的I9-487引物檢测,电泳出现对应大小的扩增条带,判定为Il9亚型禽流病毒核