美国药典微生物检测精要.doc

美国药典微生物检测精要
培训小结
一 微生物实验室规范
重要的控制点:无菌技术、培养基控制、菌种控制、设备操作与控制、数据记录与实验室布局和运作、员工培训等。
1无菌技术:防止和保持无菌物品及无菌区域不被污染的操作方法和管理方法。可通过无菌环境、灭菌、消毒、卫生要求、无菌操作技术等手段来实现。
2培养基:是微生物实验工作的核心。包括培养基制备、培养基储存、培养基质量控制。
2.1培养基制备
2.1.1根据既定的目的选用正确的培养基
2.1.2参考生产商的COA和说明书:关于配制、储存和菌种选用等。
2.1.3所用的水应为去离子水或蒸馏水,应记录用量。
2.1.4成分的称量应用校准过的天平,根据称量量的不同选择合适的天平。使用清洁的容器和工具(<1051>玻璃器皿清洁)以防外来污染和抑制剂。应记录称量量。
2.1.5加热帮助溶解时应防止过度加热,通常培养基颜色变深说明加热过度了。
2.1.6灭菌条件:
?灭菌参数应验证,验证应同时考虑无菌和培养基生长能力
?采用高压蒸汽灭菌或过滤灭菌。湿热灭菌应考虑装载分布,加热速度过慢会使培养基过度加热,通常为121℃ 15min,此时间是指培养基温度达到121℃后15min。
?保证最低SAL,在无菌和过度加热之间平衡。
?与污染物分开灭菌
?消毒结束后,不应在灭菌柜中储存培养基,过度加热会影响培养基颜色、澄清、pH和凝固能力。
2.2培养基储存
2.2.1制备培养基的储存
?琼脂培养基易受冷冻影响,低于0℃会破坏凝胶结构。
?应避光避热,密封防止水分蒸发(建议使用螺旋盖的瓶子密封,保存时间长)。
2.2.2培养基融化
?不能超过一次,以防过度加热或潜在污染。
?融化可采用水浴、流通蒸汽或微波炉加热。微波炉加热宜采用少量多次,以防过度。
?培养基融化后在40-50℃水浴中储存不应超过8小时,浇制平皿前应擦干以防污染。
2.2.3培养基标示
?培养基名称
?批号、制备批号
?制备日期、有效期
2.2.4有效期确定
?根据成分、配方、容器、储存条件等确定
?有生长能力试验数据支持
2.2.5应在验证过的条件下储存
2.2.6重要区域环控用培养基必须
?双层包装
?最终灭菌,否则进行全数培养及用前检查
2.2.7根据当地生物危险品安全程序处置过期培养基
2.3培养基质控
2.3.1灭菌后培养基检查
2.3.1.1生长能力
?每批制备的培养基均需进行
?测试菌种根据药典,供应商说明书及环境中分离得到
?测试不合格应进行调查,如无原因,或无有效纠正措施,不得使用该批号
2.3.1.2无菌
2.3.1.3pH
2.3.1.4容器/平皿的完整性
2.3.1.5抑制或指示能力
2.3.2定期稳定性检查以确认储存有效期
3菌种保藏
3.1建立标准程序处理、保存菌种,防止污染和特性变化
3.2使用前确认菌种身份和纯度
3.3根据生产商说明书复苏菌种,使用接种技术
3.4-70℃以下或冷冻干燥保存储备菌种,可延长保存周期
3.5开启后不要重新冷冻菌种,剩余部分应弃置
3.6传代次数(每接种一次即为一代)不超过5次
3.7保藏时间根据具体保藏条件确定
4设备维护
4.1定期校准、保养
4.2定期性能检查
4.3定期清洁、消毒
5实验室布局和运作
5.1防止交叉污染
5.2活动分区:无菌、环控样品的处理和培养应在无菌环境中进行
5.3当发现微生物生长,后续的工作应转移至“阳性”区
5.4环控设备应放置在待取样区域环境中并小心操作
5.5应在受控条件下小心取样
6样品处理
6.1大部分样品、水或环控样品中的微生物对操作、储存环境敏感
6.2减少样品,取样与测试间的时间间隔
6.3长时间的转移需确认转移条件对测试及样品的影响
6.4在无菌条件下,使用无菌技术取样,即使是非无菌样品
6.5取样记录:样品信息、取样日期、送样日期、人员/部门、实验室样品接受及确认
7培养基培养时间
7.1短于3天,用小时表示
7.2长于3天,用天表示(上午、下午,相同时间段)
8人员培训
8.1每个岗位应有相应培训要求,进行上岗前资质确认
9实验室文件
9.1微生物人员培训和能力确认(上岗资质)
9.2设备验证、校准和维护
9.3测试中的设备性能(如温度记录)
9.4培养基制备、无菌检查、生长能力测试、选择性测试
9.5培养基清单与控制
9.6根据程序(SOP)进行测试的重要数据
9.7数据和计算的确认
9.8经QA人员或相应领导审核过的报告
9.9超标结果调查
10实验室结果维护
10.1检测报告至少应包括:
?日期
?测试样品
?微生物检验人员名字
?程序编号
?测试结果
?偏差(如有)
?测试参数(设备、菌种、培养基)
?管理人员审核签名
10.2数据纠错:错误的地方划一横线,签名和日期,必要时说明原因
10.3测试结果
?应包含平皿计数结果(如有)
?数据分析方法应罗列在相关SOP中
?对粘贴的图表、数据骑缝签名
10.4存档:记录应存档并防止丢失,应有记录留存计划
11测试结果解释
11.1微生物数据有时不容易解释
?与人类相关的微生物群落被广泛的用于许多测试
?人员污染是始终被关心的问题
?样品或环境中的微生物并非均匀分布
?微生物检测可变范围大:可能在+/-0.5log10单位左右
11.2不符合的结果可能是由2个原因造成的:实验室错误或产品不符合。无论哪种情况,管理层必须立即被通知
11.3调查应包括:
?数据偏离的程度(严重性)
?平行数据间差异的评估
?实验室环境
?取样方法
?物料特性(存活的污染微生物)
?人员面谈
?留样评估
?测试过程
11.4纠偏计划(警戒限、行动限)
?如果发现实验室错误,需要
?纠偏措施的有效性需要跟踪和记录
11.5无效测试:由于错误将试验视作无效必须记录
11.6确认测试(复试):应有SOP描述何时进行
二 非无菌产品: 微生物计数
1 常规过程
1.1 避免产品以外的微生物的污染。
1.2去除细菌抑制/真菌抑制性。
1.3证明表面活性剂的无毒性及其与抑制剂的相容性。
2 计数方法
2.1薄膜过滤法
2.2平皿计数法:平皿浇注法,表面涂布法。
2.3最大可能性数量法(MPN):用于检测极少数量的微生物,精密度、准确度差,不适合用于霉菌。
3 生长能力测试和方法适用性
3.1 生长能力测试:
?一般考虑
?测试菌株准备
?缓冲液
?阴性对照
?培养基生长测试
3.2 计数方法适用性:
?样品制备
?接种与稀释
?中和/去除抗菌活性
?产品存在情况下的微生物的回收率
?结果与解释
4 微生物数据的可变性
4.1 成品测试
4.1.1抗菌效力测试
4.1.2 微