GBT 19539-2004 饲料中赭曲霉毒素A的测定.pdf

ICS65.120
中华人民共和国国家标准
GB/T19539-~-2004
伺料中赭曲霉毒素A的測定
Determination of ochratoxin A in feeds
2004-06-10发布
2004-10-01实施
中围国家称准化管理委贫会布
GB/T19539-2004
前言
本标准中的薄层色谱方法和酶联免疫吸附测定方法主要依据GB/T5009.96-2003《谷物和大豆
中赭曲莓毒素A的测定》中薄层色谱方法和卫生部食品卫生监督检验所建立的酶联免疫吸附法。本标
准规定以薄层色谱法为仲裁方法,酶联免疫吸附测定法为快速筛选法。
本标准由全国饲料工业标准化技术委员会提出
本标准由全国恫料工业标准化技术委员会归口。
本标准由江苏省微生物研究所负责起草。
本标准主要起草人:宓晓黎、袁建兴、李利东、丁贵平、成恒嵩。
GB/T19539~-2004
饲料中赭曲霉毒素A的测定
范围
本标准规定了赭曲霉毒素A( Ochratoxin A,以下简称OA)的薄层色谱测定方法和酶联免疫吸附测
定方法。
本标准适用于配合鋼料、侷用谷物原料中OA的测定。
薄层色谱测定方法的最低检测量为2ng,醇联免疫吸附测定方法的最低检测量为0.05ng。
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有
的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究
是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T14699.1饲料采样方法
3薄层色法(仲裁法)
3.1原理
试样中的OA经提取、液-液分配萃取、浓缩,然后进行薄层分离,限量定量,或用薄层扫描仪测定荧
光斑点的荧光强度,外标法定量。
3.2试与材料
所用试剂除另有规定,均使用分析纯试剂。水符合GB/T682中一级水的规定。
3.2.1石油醚。
3.2.2甲醇溶液(55+45)。
3.2.3三氯甲烷。
3.2.4苯-冰乙酸(99+1)。
3.2.540g/L氯化钠溶液。
3.2.6无水硫酸钠:650℃灼烧4h,冷却后贮于干燥器中备用。
3.2.7展开剂(用时选择一种):
a)甲苯-乙酸乙酯甲酸水(6+3+1.2+0.06);
b)甲苯-乙酸乙酯-甲酸(6+3+1.4);
c)苯-冰乙酸(9+1)。
3.2.8显色剂:碳酸氢钠乙醇溶液(在100mL水中溶解6,0g碳酸氢钠,加20mL乙醇)。
3.2.9薄层板:称取4g硅胶G,加约10mI.0.5%羧甲基纤维素钠水溶液于乳钵中研磨至糊状。立即
倒入涂布器内制成10cm×20cm、厚度0.3mm的薄层板,在空气中干燥后,用甲醇预展薄层板,除去
杂质,吹干,在105℃~110℃活化1h,置于干燥器内保存备用。
3.2.10OA标准储备溶液:
告:
1凡接触OA的容器,需浸入4%次氯酸钠( NAOCI)溶液,半天后清洗备用。
2为了安全,分析人员操作时要带上医用乳胶手套
称取适量的OA标准品,用苯-冰乙酸(3.2.4)配制成约10g/mLOA贮备液。贮备液置于4℃冰
CB/T19539--2004
箱中避光保存。
标定贮备液的浓度,用1cm石英比色杯,以苯-冰乙酸(3.2.4)为参比,在OA的最大吸收峰波长
333mm处,测定吸光度值A。储备液中OA的含量(X)以微克每毫升(Hg/mL)表示,按式(1)计算
X1=aXM×100
e×
式中:
A-一测定的吸光度值;
M-OA的摩尔质量(M=403g/mol);
e-OA在苯-冰乙酸中的分子吸收系数(e=555m2'/mol);
一比色杯的光径长度,单位为厘米(cm)。
3.2.11OA标准工作溶液:根据计算的OA标准储备液的浓度,精密吸取标准储备液(3.2.10)适量,
用苯稀释成浓度为1.0g/mL的标准工作溶液。
3.3仪器与设备
3.3.1小型粉碎机。
3.3.2电动振荡器。
3.3.3薄层板涂布器。
3.3.4
玻璃器皿:分液漏斗、蒸发皿、浓缩瓶。所有玻璃器皿均需用稀盐酸浸泡,依次用自来水、蒸馏水
冲洗。
3.3.5快速定性滤纸。
3.3.6展开槽:250mm×150mm×50mm(立式,具磨口
3.3.7紫外光灯:波长365nm。
3.3.8点样器:1aI~99pL。
3.3.9薄层扫描仪:配有汞灯光源
3.4试样制备
按GB/T1469.1恫料采样方法取得试样,四分法浓缩减取约200g,经粉碎,混匀,装人口瓶中
备用。
3.5分析步骤
3.5.1试样处理
称取约20g试样(3.4)(精确至0,01g),置于200mL具塞锥形瓶中,加30mL石油和100mL
甲醇溶液(3.2.2),瓶塞盖紧。振荡30min后,通过快速定性滤纸滤入分液漏斗中,待分层后,放出甲醇
水层20mL,置于100mL分液漏斗中,用pH试纸测试,一般为5~6。加入25mL三氯甲烷,振摇
2min,静置分层后,放出三氯甲烷层于另一个分液漏斗中,再用10mL三氯甲烷重复振摇提取甲醇水
层(在用三氮甲烷振摇提取时,如发生乳化现象,可滴加甲醇促使其分层),将三氯甲烷层合并于同一分
液漏斗中,加入50mIL~100mL氯化钠溶液(3.2.5),振摇,放置分层后,将三氯甲烷层放出,经装有约
20g无水硫酸钠的玻璃漏斗流入蒸发皿中,将蒸发皿置蒸气浴上通风挥干。用约8mL三氯甲烷分次
将蒸发皿中的残渣溶解,转入浓缩瓶中,置60℃水浴减压浓缩至干,加入2mL苯-冰乙酸(3.2.4)溶解
残渣,摇匀,供薄层色谱点样用。
3.5.2点样
在距薄层板下端1.5cm~2cm的基线上,以1cm的间距,用点样器依次点标准工作溶液(32.11)
2L、4ルL、7pI-、10pL(相当于2ng、4ng、7ng、10ng)和试样液(3.5.1)20L
3.5.3展开
将薄层板放入有展开剂的展开槽中,展至离原点13cm~15cm,取出,吹干。
3.5.4观察与确证
将展开后的薄层板置于波长365nm紫外光灯下,察与OA标准点(4ng)比移值相同处的试样的