罗汉果蛋白酶的贮存稳定性研究.pdf

2 0 1 1 年1 1 月 = J 7 D 8 驾型 食品研究与开发 F o o dR e s e a r c hA n dD e V e l o p m e n t 生物工程 罗汉果蛋白酶的贮存稳定性研究 梁成钦- 。周先丽1 。徐庆1 ，苏小建2 ，刘国雄2 ( 1 桂林医学院，广西桂林5 4 1 0 0 4 ；2 广西师范大学环境与资源学院，广西桂林5 4 1 0 0 4 ) 摘要：将罗汉果蛋白酶粗酶以固态或液态在有光或避光、不同温度、不同浓度的半胱氨酸、乙二胺四乙酸( E D T A ) 和葡萄糖的条件下贮存，分别在不同时间测定粗酶的相对活力，以考察这些条件对罗汉果贮存稳定性的影响。结果 表明：在这些条件下，6 0d 内，酶活都基本保持，但6 0 d 后，酶失活速度加快。其中光和温度( 一2 0 一2 5 ) 对罗汉果蛋 白酶贮存稳定性的影响不明显，但加入半胱氨酸、E D T A 或葡萄糖可减缓6 0 d 后酶活下降的速度。所以罗汉果蛋白酶 若在6 0 d 内使用的可一般存放。若6 0 d g 使用，可加入一定的半胱氨酸、E D T A 或葡萄糖贮存，以保持其活性。 关键词：罗汉果；蛋白酶；贮存稳定性 S t u d yo nt h eS t o r a g eS t a b i l i t yo ft h eP r o t e a s ef r o mt h eF r u i t so fS i m i t i aG r o s v e n o r i i L I A N GC h e n g - q i n l ，Z H O UX i a n - l i l ，X UQ i n 9 1 ，S UX i a o - j i a n 2 ，L I UG u o - x i o n 9 2 ( 1 G u i l i nM e d i c a lC o U e g e ，G u i l i n5 4 1 0 0 4 ，G u a n g x i ，C h i n a ；2 C o l l e g eo f E n v i r o n m e n ta n dR e s o u r c e s ，G u a n g x iN o r m a l U n i v e r s i t y ，G u i l i n5 4 1 0 0 4 ，G u a n g x i ，C h i n a ) A b s t r a c t ：T oi n v e s t i g a t et h er e l a t i v ea c t i v i t yo ft h ep r o t e a s ew h i c hW f l 8s o l i do rl i q u i du n d e rt h ec o n d i t i o n so f h a v i n gl i g h to rn o t ，d i f f e r e n tt a m p e r a t u r ea n dd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o no fc y s t e i n e ，E D T Aa n dg l u c o s e T h er e s u l t s h o w e dt h a tu n d e ra l lt h e s ec o n d i t i o n st h ea c t i v i t yo ft h ep r o t e a s ew a sm a i n t a i n e dw i t h i nt h ef i r s t6 0do ft h e s t o r a g ep r o c e s s ，b u ta f t e r6 0d t h ea c t i v i t yl o s s e do b v i o u s l y T h ee f f e c t so fl i g h ta n dt a m p e r a t u r e ( - 2 0 。C - 2 5 ) o nt h es t o r a g es t a b i l i t yo ft h ep r o t e a s ew e r en o to b v i o u s ，b u ta f t e r6 0do fs t o r a g ec y s t e i n e ，E D T Aa n ds h c o s e C a l ls l o wd o w nt h el o s s i n go ft h ea c t i v i t yo ft h ep r o t e a s e S oi ft h ep r o t e a s ef r o mS i r a i t i aG r o s v e n o r i is t o r a g e dn o t m o r et h a n6 0dt h a ti tc a nb es t o r a g e di ng e n e r a lc o n d i t i o n s ，o t h e r w i s eS O m eC o n c e n t r a t i o no fc y s t e i n e ，E D T A o rg l u c o s ec a nb eu s e dt om a i n t a i ni t sa c t i v i t y K e yw o r d s ：S i r a i t i ag r o s v e n o r i i ( S w i n g l e ) CJ e f f r e y ；p r o t e a s e ；s t o r a g es t a b i l i t y 罗汉果( S i r a i t i a g r o s v e n o r i i ) 是葫芦科( C u c u r b i t a n c e ) 罗汉果属植物的成熟果实1 ”，是广西的大宗经济作物阁。 目前，罗汉果除了用于医药外，还主要用于生产罗汉果 甜苷1 3 1 ，所以加强罗汉果的综合开发利用成为必然的发 展趋势。蛋白酶是目前工业用酶的主要酶制剂之一，在 食品、化工、医疗、制药等方面应用广泛 4 1 。植物蛋白酶 是蛋白酶的重要来源，目前生产最多的植物蛋白酶是 木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶。另外已经发现含有蛋白酶 的植物的还有生姜、无花果、番麻、剑麻、猕猴桃等同。 基金项目：广西教育厅专利资助项目( 桂教科研 2 0 0 8 2 7 号) 作者简介：梁成钦( 1 9 7 卜) ，男( 汉) ，助理研究员，硕士。研究方向：天 然产物化学。 通信作者：苏小建( 1 9 5 7 _ ) ，男( 回) ，教授级高级工程师，学士，研 究方向：天然产物化学。 罗汉果蛋白酶是从鲜罗汉果中发现的一种新植物 蛋白酶，其活性高嘲。现已经有关于罗汉果蛋白酶的提 取分离工艺、部分理化性质( 酶起活性作用的最适条 件，酶稳定性的最佳条件和米氏常数等) 和对大豆蛋 白的水解条件的有关研究I S ，但少见有关于罗汉果蛋白 酶贮存稳定性方面的研究报道。因为酶是一种蛋白质， 凡能使蛋白质变性的因素，如光和温度，都可能使酶失 去活性，从而会影响酶的使用，所以有必要对罗汉果蛋 白酶贮存稳定性进行研究。在本试验中，通过将罗汉果 蛋白酶粗酶在有光或避光、不同温度、不同浓度半胱氨 酸、不同浓度乙二胺四乙酸( E D T A ) 和不同浓度葡萄糖 的条件下贮存，分别在不同时间测定粗酶的相对活力， 以考察这些条件对罗汉果蛋白酶贮存稳定性的影响， 为开发利用罗汉果蛋白酶提供试验参考。 万方数据 生物工程 粱成钦，等：罗汉果蛋白酶的贮存稳定性研究 l 材料与方法 1 1 试剂与仪器 罗汉果：广西桂林荔浦和广西柳州融安；罗汉果 蛋白酶：桂林医学院科学实验中心提供；干酪素：杭州 微生物试剂厂；其他试剂均为分析纯试剂。 精密p H 计( p H S 一3 C ) ：上海精密科学仪器有限公 司；紫外分光光度计( U V 2 4 0 1 ) ：S h i m a d z u 公司。 1 2 方法 1 2 1 蛋白酶的活性测定 罗汉果蛋白酶酶活力的测定方法见参考文献 9 】， 以干酪素为底物。酶的活力单位定义：在规定条件下， lm i n 内酶水解酪蛋白释放出相当于lp , g m L 酪氨酸 在2 7 5i l l a 波长处的吸收度为1 个活力单位。 1 2 2 罗汉果蛋白酶的贮存稳定性研究 将罗汉果蛋白酶粗酶在有光或避光、不同温度、 不同浓度半胱氨酸、不同浓度E D T A 和不同浓度葡萄糖 的条件下贮存，分别在不同时间测定粗酶的相对活力， 以研究这些条件对罗汉果蛋白酶贮存稳定性的影响。 将4 0m g 罗汉果粗酶粉或1 0m L 酶液在不同的条件下密 封贮存( 将在每一条件下待测的粗酶分成7 等份) ，然后 分别在贮存后的第2 ，4 ，7 ，1 4 ，3 0 ，6 0 ，9 0 天测其酶活力， 以试验的第l 天所测得的蛋白酶活力为1 0 0 ，其它时 间测得的酶活力与之相比较，计算出酶的相对活力，并 以时间为横坐标作图。 2 结果与分析 2 1 光对罗汉果蛋白酶的贮存稳定性的影响 蛋白质一般在见光的条件下更容易变性，所以在 试验中考察了光对罗汉果蛋白酶的粗酶粉和其粗酶液 贮存稳定性的影响，结果分别见图1 和图2 。 誉 R ! g 靛 罂 g 谴 图1 光对罗汉果蛋白酶( 粗酶粉) 贮存稳定性的影响 n 参lT h ee f f e c to fl i g h tO Ut h es t o r a g es t a b i l i t yo fp r o t e a s e Ic r u d es o l i de n z y m e ) 由图l 、图2 看出，见光和避光贮存对罗汉果蛋白酶 酶粉或酶液的稳定性的影响差别不明显，因为在这2 个 承 长 ! g 莨 罂 窖 溢 圈2 光对罗汉果蛋白酶( 粗酶液) 贮存稳定性的影响 矾g 2 T h ee f f e c to fl i g h to nt h es t o r a g es t a b i l i t yo fp r o t e a s e ( c r u d el i q u i de n z y m e ) 条件下，酶活力的变化趋势还是基本一致的。所以贮存 罗汉果蛋白酶过程中避不避光并不重要。从时间上来 看，刚开始贮存时都有上升趋势，随着时间的延长，酶 活逐渐下降，但在6 0 d 内，酶活基本保持，之后，酶活下 降速度加快。9 0d 后，酶粉和酶液的相对酶活分别只有 4 7 和3 4 ，而见光条件下其值只为4 2 和2 7 。所 以从这些数据来看，酶粉比酶液更能保持蛋白酶的活 性。因为在9 0 d 后，酶粉的酶活比酶液要高1 3 以上。 另外，酶粉大概在1 4d 左右酶活力达到最大，而酶液则 在7d 左右达到最大值。 2 2 温度对罗汉果蛋白酶贮存稳定性的影响 温度对罗汉果蛋白酶贮存稳定性的影响结果见 图3 。 l471 42 13 06 09 0 时间，d 图3 温度对罗汉果蛋白酶贮存稳定性的影响 F i g 3 T h ee f f e c to ft a m p e r a t u r eo nt h es t o r a g es t a b i l i t y0 f p r o t e a s e 贮存温度对酶的活性一般有很大的影响，图3 显 示：贮存温度越低，酶活损失越慢，避光贮存9 0 d 后， 在一2 0 下贮存的罗汉果蛋白酶的活性仍为原酶活的 5 8 9 ，4 下酶活为5 2 7 ，而常温下仅为4 2 2 。但 总的来说，在这几个温度下，对酶的影响差别不明显。 2 3 半胱氨酸对罗汉果蛋白酶贮存稳定性的影响 半胱氨酸是常用的巯基蛋白酶的激活剂，通过还 原活性巯基基团中因氧化而形成的二硫键而激活巯基 蛋白酶f 1 0 1 。将不同浓度的半胱氨酸与