NYT 1736-2009 微生物肥料菌种鉴定技术规范.pdf

ICS65.080
B10
中华人民共和国农业行业标准
NY/T1736-2009
微生物肥料菌种鉴定技术规范
Technical specification of strain identification for microbial fertilizers
200-04-23发布
2009-05-20实施
中华人民共和国农业部发布
NY/T1736-2009
前言
本标准的附录A为规范性附录,附录B、附录C和附录D为资料性附录。
本标准由中华人民共和国农业部种植业管埋司提出并归口
本标准起草单位:农业部微生物肥料和食用菌菌种质量监督檢验测试中心、中国农业科学院农业资
源与农业区划研究所。
本标准主要起草人:冯瑞华、李俊、沈德龙、姜听、李力、杨小红、曹风明、关大伟、陈慧君。
NY/T1736--2009
微生物肥料菌种鉴定技术规范
范?
本标准规定了微生物肥料使用菌种鉴定程序与方法的选用原则
本标准适用于微生物肥料科研、教学、质检和生产等领域中的菌种鉴定。
规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有
的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究
是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。
NY/T11132006微生物肥料术语
术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。
细菌 bacteriunm
形体微小,结构简单,通常以二分裂方式进行繁殖的単细胞原核生物,基本形态有球状、杆状、弧状
和螺旋状。
3.2
放线菌 actinomycete
细胞呈丝状、孢子方式繁殖和高(G+C)mol%的革兰氏阳性细菌。
哮母菌
单核的单细胞真菌,以芽殖或裂殖方式行元性生殖,或形成孢子行有性生殖。
丝状真菌 filamentous fungus
蘭丝体发达,不产生肉服可见子实体的真菌
由表型特征相似、遗传性状相近的菌株组成,并与其他类群的菌株存在明显差异
菌株 strain
属于同一个种,但来源不同的单细胞或纯培养的后代。
纯培养物 pure cult
由单个细胞繁殖而来的培养物。
纯度检测 purity examination
检测菌种是否为纯培养物的过程
NY/T17362009
鉴定 identification
根据通用的检索系统,对未知微生物菌株进行性状观察和测定,确定该微生物分类地位的过程。
4鉴定原则
4.1用于鉴定的菌株应为纯培养物。
4.2依据所鉴定菌株的类群和特性,选择相应的鉴定检索系统和鉴定方法。
4.3鉴定结果应与对应的鉴定检索系统或模式茵株性状进行对比,确定菌株的分类地位。
5菌种鉴定常规流程图
待鉴定培养物
纯度检测
培养特征与
生理生化
遗传特性
茵体形态观察
特性鏊定
鉴定
鉴定绪果的分析、比较、确认及出具报告
6鉴定方法
6.1纯度检测
6.1.1菌落形态观察
在适宜培养基平板上,将待鉴定培养物划线或稀释凃布,经适宜条件下培养后,选取划线或稀释涂
布分离得到的单菌落,观察其在同一平板上的大小、形状、颜色、质地、光泽等。
1.2菌体形态观察
挑取待鉴定细薗培养物,涂布于载玻片上无菌水滴中,进行简单染色或革兰氏染色;酵佴菌和丝状
真菌制成水浸片。显微镜下观察菌体形态。
6.1.3纯度确定
菌落和体形态一致者,确定培养物符合要求。
6.2培养特征观察
6.2.1细菌菌落特征
将待鉴定培养物划线或稀释凃布于营养肉汤培养基(附录A.1)或其他适宜的细菌培养基平板上,
适宜条件下培养2d~5d后,观察和记录幼龄和老龄菌落的大小、形状、质地、边缘、隆起、颜色、光泽、透
明度等性状。
2.2放线菌培养特征
将待鉴定培养物点植、划线或稀释凃布于适宜的培养基(附录A.3~A.7)平板上,28℃培养5d
15d,观察茵落的大小、形状、表面状况、气生菌丝、基内菌丝的颜色及可溶性色素。
6.2.3酵母菌培辯特征
NY/T1736-2009
将待鉴定培养物划线或稀释涂布于麦芽汁琼脂(附录A.9)平板上,25"℃~28℃培养3~7d,观察
菌落的大小、形状、质地、隆起、边缘、颜色、光泽等性状。
将待鉴定培养物接种于麦芽汁液体培养基中,25℃C28℃培养3d,观察是否形成醭膜、茵环或岛及
沉淀。
6.2.4丝状真菌培养特征
将待整定培养物点植或稀释凃布于PDA培养基(附录A.11)或察氏培养基(附录A.8)平板上,25℃
28℃培养2d~14d,观察菌落质地、颜色、生长速度、色素的产生情况、滲出液、菌落背面的颜色等。
6.3菌体形态特征观察
6.3.1细苗形态特征
挑取在适宜培养基上生长的幼龄培养物,涂片、革兰氏染色,显微镜下观察菌体形状、大小、革兰氏
染色反应等;观察芽孢的有无、形态和着生位置
6.3.2放线菌形态特征
以斜角将灭菌盖玻片插入将要凝囧的培养基中,每个培养皿可插4~9片。沿盖玻片与培养基的交
接处划线接种放线菌,培养平板正置于28℃培养2d、5d、7d10d、15d,定期取出荒玻片,显微镜或扫描
电子显镜下观察气生菌丝、基内菌丝、孢子丝的形态,孢子着生方式、颜色或孢囊着生位置(气丝或基
丝)、孢囊的形状。
6.3.3酵母菌形态特征
将待鉴定培养物接种于麦芽汁液体培养基中,25℃~28℃培养3d,挑取一环培养物,制成水浸片,
观察细胞大小、形态和无性繁殖方式。在玉米粉琼脂(附录A.10)平板上划线接种2~3条待鉴定培养
物,上覆盖玻片,25℃~28℃培养3d~5d,低倍显微镜下观察划线处是否形成假菌丝。在适宜生孢子
培养基上观察孢子的形态特征
6.3.4丝状真菌形态特征
将待鉴定培养物接种于PDA培养基(附录A.11)或察氏培养基(附录A.8)平板或斜面上,25℃
28℃培养2d-14d,挑取少量培养物制成水浸片,或采用玻片培养法(附录B.1),显微镜下观察菌体形
态特征、无性繁殖体和有性繁殖体的形态特征(附录B2)
6.4生理生化特性鉴定
按附录C所列的待鉴定培养物类群,测定对应的生理生化项目。可以利用微生物自动鉴定系统进
行鉴定。
6.5遗传特性鉴定
细菌和放线菡进行16 S RDNA序列分析;酵母菌进行26 S IDNA中D2/D2区域序列分析或ITS序
列分析或18 SDNA序列分析;丝状真菌进行ITS序列分析或18 S TDNA序列分析。序列测定的扩增
引物见附录D。
7鉴定结果
根据实验结果,对照通用的鉴定系统,确定待鉴定菌株的分类地位。菌种名称采用国际命名规则
使用属名和种加词的拉丁词,并附加中文译名。有异名的应同时标注。
8鉴定报告
蘭种鉴定结罘报告应列出送检单位、送检时回、样品编号、名称、数量、定操作人签字、鉴定技术负
责人签字、鉴定内容、结果及参考文献等信息。采用微生物自动鉴定系统和(或)序列测定的,还应附上
原始数据