DB41∕T 1727-2018 饲料中氨基酸的测定 高效液相色谱法.pdf

ICS65.120
1DB41
河南省地方标准
DB41/T1727--2018
饲料中氨基酸的测定高效液相色谱法
2018-11-26发布
2019-02-26实施
河南省质量技术监督局发布
DB41/T1727-2018
本标准按照GB/"T1.1-2009给出的规则起草
本标准由河南省畜牧局提出并归口。
本标准起草单位:河南海瑞正检测技术有限公司、河南牧业经济学院、河南省兽药饲料监察所。
本标准主要起草人:兰尊海、单慧燕、易善平、文英会、陈晓鸽、薛宁、许亚楠、李培娜、孙世芰。
DB41/T1727-2018
饲料中氨基酸的测定高效液相色谱法
范围
本标准规定了饲料中天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、精氨酸、出氨酸、苏氮酸、脯氨酸、丙氨酸、
缬氨酸、蛋氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸、酪氨酸和色氨酸共18种
氨基酸的测定方法。
本标准适用于饲料原料和饲料中氨基酸含量的测定。
酸水解法适用于除色氨酸外其它氨基酸的测定;碱水解法只适用于色氨酸的测定。
2规范性引用文件
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GB/T18216饲料中氨基酸的测定
3原理
蛋白质在盐酸或氢氧化钠的作用下,水解成单一氨基酸,水解后的氮基酸与衍生试剂反应,形成稳
定的黄色行生物,经Cs色谱柱分离,紫外检测器检测,与氨基酸标准峰比较,按外标法计算各氨基酸
的含量。
4试剂和材料
4.1试剂
4.1.1盐酸(HCL):浓度≥36%,优级纯。
4.1.2氢氧化钠(NaOH):优级纯。
4.1.3乙腈(C2H3N):色谱纯
4.1.4碳酸氢钊( NAACC3)
4.1.5无水乙酸钊(C2H3NaO2)。
4.1.6磷酸二氢钾(KIl2PO4)
4.1.7N,N二甲基甲說胺(C3HNO):色谱纯
4.1.8冰乙酸( Cl COOIL)。
4.2试剂配制
4.2.1盐酸溶液(6mol/1.):取500m.盐酸加水稀释个1000mM,混匀。
4.2.2氢氧化钠溶液(5mol/L):称取200g氢氧化钠,溶于200mL水中,冷却至
室温后,用水稀释至1000m?L,混匀。
DB41/T1727-2018
4.2.3平復缓冲浴液(pll7.0):称取3.4g磷酸二氢钾加入145.5mL0.1mol/L的
氰氧化钊溶液,用水稀释至500m,混匀,抽滤,存于棕色瓶中。
4.2.4衍生试剂(1%):称取1g氟苯,用乙腈浴解稀释至100m,混匀。
4.2.5衍生缓冲液(pH9.0):称取21.0g碳酸氢钠加入470mM.水溶解过滤,加入
30m.乙腈于500ml.试剂瓶中。
4.2.6流动相(0.05mo11.):称取4.1g无水乙酸钩,加入100m,N,N-ー二甲基甲酰
胺定容?1000ml.容量瓶中,用20%冰乙酸调节pH?6.4,备用
4.3标准品
4.3.1混合氨基酸标准溶液:经国家认证并授予标准物质证书的标准浴液。
4.3.218种单个氨基酸标准品:固体,纯度≥98%。
4.4标准品配制
4.4.1混合氨基酸标准工作液(100ug/mL):购买市售的氨基酸标准浴液。
4.4.2L-色氨酸标准工作液(100甲g/mL):准併称取L色氨酸标准品约10.00mg,溶
于少许水和数滴0.1molL氢氧化钠溶液中,冷却至室温,用水稀释至100mL,混匀,
为标准上机液。
5仪器和设备
5.1实验室用粉悴机
5.2样品筛:孔径0.25mm
5.3分析天平:感量为0.1mg
5.4电热鼓风干燥箱
5.5真空泵。
5.6喷灯。
5.7快速泥匀器。
5.8高效液相色谱仪:附紫外检测器、二元泵或四元泵、柱温箱。
6分析步骤
6.1试样制备
取具代表性的饲料样品,用四分法缩分取250g左右,粉碎并过筛0.25mm孔径(40日)筛,充
分混匀后装入样品瓶(或袋)中备用
6.2试样水解
酸水解法:称取0.1g~0.5g试样(准确至0.0001g)于9p1.8cm×20cm水解管中,加10mL
盐酸溶液(4.2.1)后,按照GB/T18246-2000中3.1进行酸水解处理。
打开水解管,将水解液过滤至50m.容量瓶中,用少量水多次冲洗水解管,水解液移入同一容量瓶
中,最后用水定容至刻度,振荡混匀。
碱水解法:称取O0.1g~0.6g饲料试样(准确至0.0001g)于q1.8cm×20cm水解管中,加
10mL氢氧化钠溶液(4.2.2)后,按照GB/T182462000中3.2进行碱水解处理
DB41/T1727-2018
打开水解管,先用10L的盐酸溶液(4.2.1)转移至50L容量瓶中,用少量水多次冲洗水解管,
水解液移入同一容量瓶内,最后用水定容至刻度,振荡混匀。
6.3试样衍生
准确移取样品溶液和标准溶液各10u[.于小试管中,抽干,准确加入衍生缓冲液20L,用快速
混匀器混匀,再加衍生试剂20p1,混匀,封口膜封口,放入电热鼓风干燥箱中60℃行生30min,
取出放不室温,加平衡缓冲液160I,混匀。
6.4色谱条件
6.4.1二元或四元泵高效液相色谱仪
6.4.2紫外检测器。
6.4.3柱温箱。
6.4.4手动或自动进样器。
6.4.5色谱柱:C1柱(内径:4.6mm,长:250mm,粒径5um)。
6.4.6流动相:A-0.05mol/L乙酸钠溶液:B-乙情:水=1:1。洗脱梯度见表1。
表1洗脱梯度
时间,min
A%0
B%
0.0
84.0
16.0
0.3
84.0
16.0
4.0
69.0
61.0
36.0
7.0
45.0
55.0
28.0
60.0
7
0.0
100.0
0.0
100.0
84.0
16.0
10
46.0
84.0
16.0
6.4.7流速:1.20m./min。
6.4.8柱温:25℃
6.4.9檢测波长:360rma
6.4.10进样量:10uL
6.5试样的测定
混合氨基酸标准工作液和样品测定液分别以相同体积注入高效液相色谱仪,以外标法通过峰面积计
算样品测定液中氮基酸的含量。
7分析结果的表述
7.1样品中氨基酸含量的计算
样品测定液氮基酸的含量按下列公式计算