罗非鱼源Ⅰa和Ⅰb血清型无乳链球菌可溶性蛋白差异分析.pdf

第30卷第2期
连海洋大学学报
Vol 30 No. 2
2015年4月
JOURNAL OF DALIAN OCEAN UNIVERSTTY
Apr.2015
DO1:10.3969/J.ISSN.2095-1388.2015.02.003
文章编号:2095-1388(2015)02-0125-07
罗非鱼源Ia和b血清型无乳链球菌
可溶性蛋白差异分析
石云良2,李莉萍,王瑞,梁万文,甘西
黄婷,李健,黄维义23,陈明
(1.广西水产科学院广西水产遗传育种与健康养殖重点实验卒,南宁530021:2.广西大学动物科学技术学院,南宁530005;
3.广西大学食品质量与安全研究中心,南宁530005)
摘要:前期研究表明,罗非鱼 Oreochromis niloticus la和b血清型无乳链球菌 Streptococcus agalactia疫苗之
间缺乏交叉保护力,为了从蛋白分子水平探讨其免疫原性差异的原因,在提取岁非鱼Ia和Ib血清型无乳
链球菌可渀性蛋白后应用二维差异凝胶电泳( two dimension- Difference Gel Electrophoresis,2D-DIGE)分析
其表达差异蛋白点,应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱( MALDI-TOF-MS)鉴定这些差异蛋白,并
使用 DAVID生物学数据库预测经鉴定后获得的蛋自功能。结果表明:在2D-DIGE电泳上,Ia和b两利和不
同血清型无乳链球菌具有167个表达差异蛋白点,对这些蛋白点进行质谱分析获得32种蛋白,这些蛋白主
要与氧化还原反应、代谢与能量前体物产生、糖代谢反应等生物学过程有关,主要参与糖解和糖异生作
用、丙酮酸代谢与脂肪酸生物合成等通路;对蛋白功能的预测表明, GAPGH、半胱氨酸合成晦和锰依赖性
锰超氧化物歧化酶的功能与免疫和疫苗研发相关。本研究首次证实,罗非伯Ia和h血清型无乳链球菌存
在较多的表达差异蛋白,部分表达差异蛋自的功能与免疫和疫苗研发相关,这可能与链球菌免疫原性有直
接关系,但需要进一步地研究和证实。
关键词:罗非鱼;无乳链球菌;Ia和b血清型:可溶性蛋白;二维差异凝胶电泳(2D-DICE);差异分析
中图分类号:0954.4
文献标志码:A
链球菌 Streptococcosis病是罗非鱼 Oreochromis蛋白进行多肽质谱分析获得17种不同的蛋白,这
niloticus养殖中危害最为严重的病害,呈全球性流些蛋白的鉴定为筛选诊断候选分子和疫苗候选分子
行,每年给世界罗非鱼养殖造成巨大经济损失。据奠定了良好的基础。
统计,在2009-2012年该病给中国罗非鱼养殖业
已有研究证实,岁非鱼Ia与b血清型无乳链
造成的经济损失累计达16亿美元り。至今尚未找球菌的全菌苗之间未能产生有效的交又保护
到有效的药物治疗方法和预防控制措施。
为此,本研究中拟从蛋白分子水平分析这两种不同
为了获得新的疫苗候选分子和新药物靶点,已血清型无乳链球菌可浴性貨白的差异,通过貨白功
有学者开始对鱼链球菌蛋白组进行相关的鉴定研能预测初步探讨这些差异蛋白与免疫原性之间的关
究。 Hughes等2分离和提取无乳链球菌 Streptoco-系。
cus agalactiae可作为疫苗候选分子的菌体外层蛋
白,用2D电泳分离后经质谱测定获得14种蛋白,
材料与方法
其中6种为用无乳链球菌首次鉴定的蛋白。Shin
等3对海豚链球菌的可溶性蛋白进行2D电泳分
材料
离,获得大约320个蛋白点,对部分高丰度表达的
Ia血清型菌株分离自广西的罗非鱼(编号
收稿日期:2014-06-27
基金项目:广西科技发展“十ニ”规划重大专项(14121004-2-4);广西壮族自治区“八桂学者”岗位专项资金资助项目(BGX7
TFY-04);广西岁非角产业创新川队岗位科研经费(GXBY-03);广西自治区直属公益性科研院所基本科研业务费(GXIF
2014-010):广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室开放课题(CXKI-AQUA-2013-C.-02
作者简介:石ム良(1982-),男,博十研究生。ド-mail:yuanliang2008@126.comn
通信作者:陈明リ(1981-),男,副研究员,博士。-mail:cm990919@163.con
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大连海洋大学学报
第30卷
GX032),b菌株血清型分离自海南省的罗非鱼液,再将IPG胶条转移至大试管中,加入平衡缓冲
(编号HNO16)
液1(包令6mol/L尿素、50mmol/ L ris-HCl
1.2方法
20%甘油、2%SDS+0.1%DTT)后,将试管放在
水平摇床上缓慢摇晃15min。第一次平衡结束后,
1.2.1茵株的分离培养和鉴定无菌条件下采集彻底倒掉胶条平衡缓冲液Ⅰ,并用滤纸吸取多余平
患病罗非鱼的脑、肝和鳞条基部并划线接种于血平衡液。再加入胶条平衡缓冲液皿(包含6mol/L尿
板上,28℃下培养24~48h;对菌落进行革兰氏素、50mmol/l.Tis-HCl、20%甘油、2%SIS+4%
染色观察,并挑取染色结果为链球菌的单个菌落进碘乙跣胺),继续在水平摇床上缓慢摇晃15min
行纯化;纯化培养的单个菌落于TSB中(28℃)平衡结束后,彻底倒掉样品水化盘中的胶条平衡缓
培养24~48h,加入20%甘油置于超低温冰箱冲液Ⅱ,并用滤纸吸取多余平衡液。将IPG胶条从
(-80℃)中保存或直接使用。罗非鱼的CX032和试管移出,用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸没
HNO16血清型无乳链球菌使用API20 Strep系统在1×电泳缓冲液中。然后将胶条胶面朝上放在凝
( Bio Merieux, Marcy Etoile, France)进行鉴定,胶的长玻璃板上。将制备好的15%丙烯酰胺SDS
培养温度为25℃。
PAGE胶用低熔点琼脂糖封顶,将PC胶与聚内烯
1.2.2细菌可溶性蛋白的提取将250ml,细菌培酰胺凝胶胶而完全接触,放置5min使低熔点琼脂
养液[密度为(2.0~5.0)x10°cl/mL)]在4℃下糖封胶液彻底凝固。将凝胶转移至电泳槽中进行
以10000r/min离心10min,沉淀用PBS洗涤3次SDS-PACE电泳( Ettan DALT Twelve system,Am
后加入2ml裂解缓冲液(包含7mol/L.尿素、2 ershan)。起始时用低电流(5~10mA/gel/17cm
mol/L硫尿、4% CHAPS、30mmol/ L Tris-HCI),运行,待样品在完全跑出IPG胶条并浓缩成一条线
反复冻融6次,每次15min,然后在冰上用超声波后再加大电流(20~30mA/gel/17cm)运行,直
粉碎45min(超声10s,间隔20s,振幅70%),到溴蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。电
在4℃下以15000r/min离心30min,收集上清可泳后的蛋白凝胶参照银染试剂盒( Thermo Scientif
溶性蛋白于-80℃下保存备用。用 Bradford法蛋白ic)说明书方法进行染色,然后在成像系统下进行
定量测定蛋白浓度』,以牛血清白蛋白(BSA)作成像。另外,制作一块主质胶( Master J胶),分别
为标准貨白,制作蛋白浓度标准曲线。
加入150ルgGX032、HNO16可溶性蛋白以及150
1.2.3两种不同血清型菌株可溶性蛋白的2D电gGXO32与