分光光度法快速检测细菌.pdf

第 3 8卷 2 0 1 0年 4月 分析化学 ( F E N X I H U A X U E) 研究简报 C h i n e s e J o u r n a l o f An a l y t i c a l Ch e mi s t r y 第 4期 57 3 57 6 DOI：1 0 3 7 2 4 SP J 1 0 9 6 2 0 1 0 0 0 5 7 3 分 光 光 度 法快 速 检 测 细菌 李冬 阳 茹柿平 吴 坚 应义斌 ( 浙 江大学生物系统工程与食 品科学 学院 ， 杭州 3 1 0 0 2 9 ) 摘要采用分光光度法来检测完整 细胞 内 H 0 酶 的活性 ， 以实现细 菌的快 速检测 。由于细 菌( 本研 究 以 E c o l i D H 5 a为模 型) 内含有 H O 酶 ， 当往菌液 中加入 H ： O ： 时 ， H O 会在 胞 内 H O ：酶的作用下 分解 ， 其分 解 过程遵循一级动力学反应 。通过测量该 反应 中 H O 在 2 4 0 n m处 吸光度 的变化 ， 可 以得 出该 一级 反应 的 速率 常数 ， 从而获悉菌液 的浓度 。结果表明 ： 大肠杆 菌单位 细胞浓 度酶 活为 4 21 0 L ( s c e l 1 ) ， 其 速率 常数 与浓度 在 5 71 0 。 5 71 0 c f u mL范 围内呈现 良好 的线性关 系 ， 检 出限为 5 7 X1 0 。 c f u m L 。本方法 是一种 检测 细菌总数的快速方法 ， 测试时间为 51 0 m i n 。 关键 词细菌检测 ； 过氧化氢 酶 ； 酶活性 ； 分光光度法 ；生物传感器 1 引 言 摄人含有细菌或细菌毒素的食品会引起细菌性食物中毒。美 国疾控 中心 ( C D C )估计 ， 美国每年食 源性致病菌的病例约 7 6 0 0万 ， 其中 5 2 0 0例死亡 。1 9 9 9 2 0 0 0年 ， 在我 国东部部分地 区发生 了较大 规模 的 E c o l i 0 1 5 7 ： H 7爆发 ， 对我国经济造成了重大损失 J 。解决由细菌性中毒引发的食品安全 问题尤 为紧迫 。然而 ， 由于 目前检测手段普遍存在耗时长 、 操作复杂和成本高等问题 ， 严重制约了食品安全监控 技术和管理体系的完善及实际运行 。因此 ， 建立 和推广准确 、 快速和低成本 的细菌检测技术很有必要。 目前 ， 快速检测细菌的技术主要包括聚合酶链式反应 ( P C R) 、 酶联 免疫 吸附 (E L I S A) 和生物传感 器 等。P C R技术灵敏度高 ， 相对耗时短 ， 但对操作人员的技术要求较高 。E L I S A技术较为成熟 ， 但 成本较高 ， 用于显色的苯类有机试剂易对人和环境造成不利影 响。生物传感器作为一种新兴技术 ， 以其 检测快速而闻名 ， 但由于其构成涉及敏感的生物材料 ， 稳定性和重复性 问题 ，严重影响着这项技术投入 量产。近年来 ， 通过检测样品中与细胞浓度成正 比的细胞 内含物( 如 A T P 和酶 ) 来快速监测细菌已 引起 了广泛关注。酶 中以监测 H O 酶( C a t a l a s e ) 的活性来检测细菌的研究最多。由于 H O 酶会催化 分解 H O 而产生氧气和水 ， 检测 H O 酶的活性需监测反应 中产物 ( O ) 的增加或反应物 ( H O ) 的减 少。 目前 ， 通过监测 H O ， 来测过氧化酶活性 的方法主要有滴定法 J 、 形成中间产物 比色法 、 化学发 光法 、 荧光法 n j 、 电化学法 J 2 j 和分光光度法 引。其中电化学法和分光光度法最为简便 ， 它们不仅可 以实现实时监测 ， 也无需引入额外的试剂。电化学法 因电极易受样 品污染等因素导致其稳定性和重复 性较差 ； 分光光度法灵敏度相对要低 ， 但稳定性好 。分光光度法 的应用多限于对纯酶的研究 ， 且通过 间 隔( S t o p w a t c h ) 手动测吸光值来研究动力学过程 ， 尚未见将该法用于完整细胞 H O 酶活测试 的报道。 本研究采用分光光度计法的动力学实时测量模式来监测与完整细胞作用时 H O 的变化 ， 并 以此 测定酶活性 ， 建立了定量测试细菌浓度的方法。 2 实验部分 2 1 仪 器与试 剂 2 5 5 0紫外分光光度计(日本 岛津公司 ) ； 级生物安全柜 ( 新加坡 E S C O公 司)； 高速冷冻离心机 ( 德国 S O V A L L公 司 ) ；S P X一 2 5 0智 能生 化 培 养 箱 ( 赛 福公 司 ) ； 全 自动 灭 菌锅 ( 台湾 浩 翰公 司 ) ； S K 3 3 0 0 H P超声清洗器( 科导公司) ； B S 2 2 4型电子天平 ( 德国 S a r t o r i u s 公司) ； 数据分析采用 O r i g i n软件 。 2 0 0 9 -08 1 0收稿 ； 2 0 0 9 1 2 - 0 2接受 本文受教育部新世纪人才项 H( N o N C E T - 0 7 - 0 7 2 5 ) 、 浙江省重点科技项 目( N o 2 0 0 8 C1 4 0 7 7 ) 和国家科技专项 ( N o 2 0 0 9 Z X 0 8 0 1 2 - 0 0 4 B) 资助 $ E m a i l ：w u j i a n 6 9 z j u e d u c n 5 7 4 分 析 化 学 第 3 8卷 L B培养基 ， 1 0 m m o l L P B S缓冲液( p H 7 4 ) ， 3 0 H 2 O 2 溶液( 国药集 团) ， 所用试剂均为分析级以 上；实验用水通过去离子水机( 法 国 Mi l l i p o r e 公司) 制各。 2 2实验方 法 2 2 1 大肠杆菌 的培养与计数 大肠杆菌 E c o l i D H 5 c 由浙江大学食品系提供 。用 L B培养基在 3 7 q c 条件下培养 2 4 h ， 在 4 c c、 8 0 0 0 g 条件下离心 1 5 mi n ， 取出上清液， 将菌泥再用 P B S悬浮 ， 之后再 离心( 5 mi n ) 和悬浮两次以确保得到将培养基冲洗干净的细菌悬浮液。取 0 1 m L所得菌液进行梯度稀 释， 采用传统的平板计数法计数。将其余的菌液稀释得到不同浓度待测菌液样 品。为方便表示 ， 将离心 后所得到的E c o l i 菌原液浓度定义为 E 0 ， 意为 0倍稀释 ； 其逐步倍 比稀释得到 0 5 E 0 ， 0 2 5 E 0 ， 0 1 2 5 E 0 ； 将菌原液进行 6个梯度的稀释得 E 一 1 ， E 一 2 ， E 一 3 ， E _ 4 ， - 5 和 E 一 6 ， 其倍 比 稀释后的表示方法与 0 类似。 2 2 2 H O： 检测波长的选择以去离子水为参 比， 对不 同浓度梯度 H O ： ( 0 0 11 mo l L ) 进行波长 扫描 ( 2 0 0 3 5 0 ri m) ， 确定最佳检测波长 2 4 0 r i m； 在此波长下 ， 测试不同浓度的 H 2 0 的吸光度。 2 2 3 不同浓度的细菌与 H。 o： 作用的动力学实验 分别在不 同浓度的菌液 中加入 H O ： ( 最终浓度 为1 0 m m o l f L ) ；由于浓度超过 1 0 c f u m L的菌液都有较强的背景吸收， 需用合适的参比消除背景干扰 ， 其参比和样品配制见表 1 。 表 1 不同浓度 的细菌与 H ： 0 作 用时的空 白和样品组成 Ta b l e 1 Co mp o s i t i o n o f b l a n k a nd s a mp l e wh e n b a c t e r i a o f d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s a e t wi t h H2 O2 加入 H 2 O 2 ， 反应即刻开始 ； 初始的吸光值应接近于 0 5； 记录吸光值下降过程 3 0 0 s ( S t a r t t h e r e a c t i o n b y a d d i t i o n o f H 2 0 2 ； f o l l o w t h e d e c r e a s e i n a b s o r b a n c e wi t h a r e c o r d e r f o r 3 0 0 s ) 。 3 结果与讨论 3 1 H： O ：的光谱特性 由于 H 0 ： 酶 H 0 ： 反应的产物为 0 和 H ： 0， 这两者在紫外波段都没有光吸收， 因此 ， H O ：的紫 外吸收可以直接表征该酶反应体系中 H ： 0 的浓度 。0 0 1 1 0 mo l L H ： 0 在 3 5 0 2 0 0 n m的波长扫 描光谱如图 1所示 ， H ： 0 的吸光度 随波长的减小而增大。B e e r s 等选取 了 2 4 0 n m研究 H O ： 酶一 H 0 反应中不 同浓度 的 H O 酶 的动力学 曲线 引； 考虑 到 B e e r s 法在测酶活性方面的广泛应用 、 紫外段仪器 光源的稳定性和 2 0 0 i l m 附近菌液的干扰吸收增大 ， 本研究选用 2 4 0 n ll l t 为 H O 检测波长 ， 1 0 m m o l L为 起始 H ： 0 ： 浓度 。在该波长下 ， H ： 0 ：吸光度 随浓 度变化的曲线如图 1中插图所示。 3 2 H： O： 和 大肠杆 菌在 2 4 0 a m 处 的稳 定性 分别记录 1 0 m mo l L H 0 以及不同浓度的菌液 在 2 4 0 n m处的吸光值随时间变化 的响应 曲线 ， 发现 1 0 ra i n内吸光度变化小于 0 0 0 4 ， 相比于 01吸光度 范围内仪器 自身测光准确度( 0 0 0 2 0 O 0 4 ) 可知 ， H O 和大肠杆菌在 2 4 0 n m波长照射下非常稳定。 3 3 不 同浓 度的细菌 与 H： o： 作 用 的动力学 对于一级反应有如下关系式 ： 一 d c d t： k c f 1 ) r 】 l-瞄强尊印嘲黼嘲睇翱 2 0 第 4期 李冬 阳等 ： 分光光度法快速检测细菌 5 7 5 式 ( 1 ) 积 分整 理后 得 ： C =C O e x p (一 ) ( 2 ) 式( 2 ) 表示了一级反应 中的反应物浓度随时间变化的规律 _ 】 。若 以 l n c 对时间 t 作图应得到一条直线 ， 而直线斜率的负值就是反应速率常数 k 。由 L a m b e r t B e e r 定律有A=e b c ， 可知( 2 ) 式还可以表述为 ： A =A 0 e x p ( 一 ) ( 3 ) H 0 ： 酶催化分解 H ： 0 ：的反应为一级反应 ， 其活性最佳 p H范围为 6 8 7 5 1 4 。本研究 中采用 p H 7 4的 P B S缓 冲液为测试工作液。图 2为1 0 mm o L L H ： 0 与不同浓度的细菌作用时的动力学 曲线 ( 菌原液的浓度 E 0 为 5 7 x 1 0 c f u mL ) ， 将所得 曲线用两种方法进行数据处理来计算酶活。 方法一： 以速率 常数 表示 酶活性 。用 方程Y= Y 。 + A 。 e x p (一 k x ) 1 6 i 进行拟合。图 2以菌原液 E E O 为例 ， 其拟合线与实测线的重合性 良好 ， 最终拟合出的方程为 Y= 0 0 3 0 7+ 0 3 5 7 8 1 e x p (一 0 0 1 6 2 9 x ) ， R = 0 9 7 5 6 5 。这表明完整细胞 ( I n t a c t c e l 1 ) 内 H O 酶与 H O 的作用仍遵循一级反应。按 同样的拟合方 法 ， 得到各个菌液浓度下的速率常数 k值和相关性 值