SNT 2206.12-2014 化妆品微生物检验方法 第12部分绿脓杆菌 PCR法.pdf

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中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T2206.12-~-2014
化妆品微生物检验方法
第12部分:绿胶杄菌PCR法
Determination of microorganism in cosmetics-
Part12: PCR method for Pseudomonas aeruginosa
2014-04-09发布
2014-11-01实施
中华人民共和国
国家质量嗌慆检验检疫总发布
SN/T2206.12~-2014
前言
SN/T2206《化妆品微生物检验方法》共分为13部分
第1部分:沙门氏菌;
第2部分:需氧芽孢杄菌和蜡样芽孢杆菌
第3部分:肺炎克雷伯氏菌;
第4部分:链球菌;
一第5部分:肠球菌;
第6部分:破伤风梭菌;
第7部分:蛋白免疫印迹法检测疯牛病病原
第8部分:白色念珠菌;
第9部分:胆汁酸耐受革兰氏阴性菌;
一第10部分:金黄色葡萄球菌PCR法;
第11部分:金黄色葡萄球菌多重实时荧光PCR法;
一第12部分:绿脓杆菌PCR法;
第13部分:嗜麦芽窄食单胞菌
本部分为SN/T2206的第12部分。
本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。
本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。
本部分起草单位:中华人民共和国山东出入境检验检疫局。
本部分主要起草人:孙军、赵晗、田国宁、张金玲、官小明、郝莹、王洪兵、张艺兵、孙涛
SN/T2206.12-2014
化妆品微生物检验方法
第12部分:绿脓杆菌PCR法
范围
SN/T2206的本部分规定了化妆品中绿脓杆菌的PCR检测方法
本部分适用于化妆品中绿脓杄菌的检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件
GB7918.1化妆品微生物标准检验方法总则
GB7918.4化妆品微生物标准检验方法録肢杆
SN/T1193基因检验实验室技术要求
3术语、定义和缩略语
下列术语、定义和缩略语适用于本文件
3.1术语和定义
绿脓杆菌 Pseudomonas aeruginosa
亦名为铜绿假单胞菌,具荚膜、鞭毛,为无芽孢的革兰氏阴性杆菌,能分解蛋白质,发酵槽类能力较
低,能产生绿脓菌素和荧光素。
3.2缩路语
PCR:聚合酶链式反应,简称PCR( polymerase chain reaction)
DNA:脱氧核糖核酸( deoxyribonucleic acid)
dNTP:脱氧核苷酸三磷酸( deoxyribonucleoside triphosphate)
Tag酶: Tag DNA聚合酶
4方法提要
化妆品经增菌后,提取基因组DNA,以提取的DNA为模板进行绿脓杆菌外毒素A基因高保守片
段的PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物是否有397bp的特征条带,从而对化妆品中是否污染
绿脓杄菌进行快速检验。
SN/T2206.12-~-2014
5试剂和材料
5.1 SCDLP液体培养基(见A.1)
5.2DNA提取液:主要成分是SDS、Tris、EDTA。
5.3酚-氯仿。
5.4异丙醇。
5.5PCR扩增引物及目标片断(见附录B)。
5.6灭菌双蒸水。
5.710×PCR缓冲液(见A.2)。
5.8琼脂糖。
5.96X上样缓冲液(见A.3)。
5.1050×TAE缓冲液(见A.4)
5.11DNA分子量标记物:DL.2000。
5.12 Eppendorf管和PCR反应管。
6仪器设备
6.1恒温培养箱:36℃士1℃。
6.2PCR仪
6.3电泳仪
6.4凝胶分析成像系统。
6.5冷冻离心机:离心力12000g。
6.6可调移液器:5pl、10a-、100pL、1000pL。
7操作步骤
7.1样品增菌
按照GB7918.1方法制备1:10化妆品稀释液,取稀释液10mL加到90 ML SCDLP液体培养基
中,置36℃士1℃培养18h~24h.
注:如无SCDI.P液体培养基时,可用普通营养肉汤培养基。检验含有防腐剂的化妆品时,在每1000mL.普通肉汤
中加入1g卵磷脂、7g吐温80
7.2模板DNA的提取
取样品增菌液1mL加到1.5mL无菌离心管中,8000r/min离心5min,尽量吸弃上清;加人
750LDNA提取液,沸水浴5min,加酚-氯仿(1:1体积比)700,振荡混匀,12000r/min离心
5min;吸取上清至对应无菌离心管中,加入等体积氯仿,混匀后12000r/min离心5min;吸取上清至
对应无菌离心管中,加入0.6倍体积预冷的异丙醇,混匀,12000r/min离心5min;轻轻倒去上清液,倒
置于吸水纸上,吸干液体,不同样品应在吸水纸不同地方吸干,70%乙醇冲洗一次,12000r/min离心
min;弃上清,沉淀溶于20&L核酸溶解液中,保存在一20℃备用。也可使用等效的商业化DNA提取
试剂盒并按其说明制备模板DNA。