GB-T 16347-1996 乳酸菌饮料中乳酸菌的微生物学检验.doc

中华人民共和国国家标准 GB/T 16347-1996 乳酸菌饮料中乳酸菌的微生物学检验 Microbiological examination of lactic acid bacteria in yoghurt beverage   1 主题内容与适用范围 本标准规定了乳酸菌饮料中乳酸菌检验的技术要求。 本标准适用于以鲜乳、乳粉或辅以大豆等为原料，经乳酸菌发酵加工制成的具有相应风味的活性乳酸菌饮料。   2 引用标准 GB 4789.28 食品卫生微生物学检验 染色法、培养基和试剂   3 术语 乳酸菌：一群能分解葡萄糖或乳糖产生乳酸，需氧和兼性厌氧，多数无动力，过氧化氢酶阴性，革兰氏阳性的无芽胞杆菌和球菌。 乳酸菌菌落总数：检样在一定条件下培养后，所得1mL检样中所含乳酸菌菌落的总数。   4 设备和材料 4.1 温箱：36±1℃。 4.2 冰箱：0~4℃。 4.3 恒温水浴：46±1℃。 4.4 电炉：可调式。 4.5 吸管：容量为1，10和25mL。 4.6 广口瓶或三角瓶：容量为500mL。 4.7 平皿：直径为9cm。 4.8 试管：18 × 180mm。 4.9 显微镜。   5 培养基和试剂 5.1 改良TJA培养基（改良番茄汁琼脂培养基）。 5.2 改良MC培养基（Modified Chalmers培养基） 5.3 0.1%美兰牛乳培养基。 5.4 6.5%氯化钠肉汤。 5.5 pH9.6葡萄糖肉汤。 5.6 40%胆汁肉汤。 5.7 淀粉水解培养基。 5.8 精氨酸水解培养基。 5.9 乳酸杆菌糖发酵管。 5.10 七叶苷培养基。 5.11 革兰氏染色液：按GB 4789.28规定执行。 5.12 3%过氧化氢溶液：按GB 4789.28规定执行。 5.13 蛋白胨水、靛基质试剂：按GB 4789.28规定执行。 5.14 明胶培养基：按GB 4789.28规定执行。 5.15 硝酸盐培养基、硝酸盐试剂：按GB 4789.28规定执行。 5.16 生理盐水：定量分装于三角瓶和试剂管内灭菌。   6 乳酸菌菌落总数的测定 6.1 检验程序 乳酸菌菌落总数检验程序如下： 检 样 作成几个适当倍数的稀释液 选择2~3个适当稀释度，各以1mL之量加入灭菌平皿内 每皿内加入适量改良TJA或改良MC培养基                           36±1℃ 72±3h 菌落计数 报 告             6.2 操作步骤 6.2.1 以无菌操作将经过充分摇匀的检样25mL（或25g）放入含有225mL灭菌生理盐水的灭菌广口瓶内作成1:10的均匀稀释液。 6.2.2 用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液）。 6.2.3 另取1mL灭菌吸管，按上述操作顺序，作10倍递增稀释液，如此每递增一次，即换用1支1mL灭菌吸管。 6.2.4 选择2~3个以上适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作两个平皿。 6.2.5 稀释液移入平皿后，应及时将冷至50℃的乳酸菌计数培养基（改良TJA或改良MC）注入平皿约15mL，并转动平皿使混合均匀。同时将乳酸菌计数培养基倾入加有1mL稀释液检样用的灭菌生理盐水的灭菌平皿内作空白对照，以上整个操作自培养物加入培养皿开始至接种结束须在20min内完成。 6.2.6 待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃温箱内培养72±3h取出，观察乳酸菌菌落特征（见表1），选取菌落数在30~300之间的平板进行计数。计算后，随机挑取52上菌落数进行革兰氏染色，显微镜检查并做过氧化氢酶试验。划兰氏阳性，过氧化氢酶阴性，无芽胞的球菌或杆菌可定为乳酸菌。根据证实为乳酸菌菌少计算出该皿内的乳酸菌数，然后乘其稀释倍数即得每毫升样品中乳酸菌数。例如，检样10-4的稀释液在改良TJA琼脂平板上，生成的可疑菌落为35个，取5个鉴定，证实为乳酸菌的是4个，则1mL检样中乳酸菌数为： 6.3 乳酸菌在改良TJA和改良MC培养基上菌落生产形态特征见表1。 表1 乳酸菌在不同培养基上菌落特征   改良TJA 改良MC 杆菌 平皿底为黄色，菌落中等大小，微白色，湿润，边缘不整齐，直径3±1mm，如棉絮团状菌落 平皿底为粉红色，菌落较小，圆形，红色，边缘似星状，直径2±1mm，可有淡淡的晕 球菌 平皿底为黄色，菌落光滑，湿润，微白色，边缘整齐 平皿底为粉红色，菌落较小，圆形，红色，边缘整齐，可有淡淡的晕 注：干酪乳杆菌在改良TJA培养基上为圆形光滑，边缘整齐，侧面呈菱形状。   7 乳酸菌的鉴定 对上述分离到的乳酸菌需进行菌种鉴定时，则作以下试验。 7.1 菌种制备：自平板上未免取菌落，接种于改良TJA或改良MC琼脂斜面，于36±1℃，24~48h培养，刮取菌苔，分别进行下列试验。 7.2 乳酸杆菌鉴定试验：极少见还原硝酸盐，不液化明胶，不产生靛基质和硫化氢。 7.3 常见乳杆菌属内种的碳水化合物反应，见表2。 7.4 产乳酸的链球菌的鉴别试验，见表3。 表2 常见乳杆菌属内种的碳水化合物反应   七叶苷 纤维二糖 麦芽糖 甘露醇 水杨苷 山梨酸 蔗糖 干酪乳杆菌 干酪亚种 保加利亚乳杆菌 嗜酸乳杆菌 乳酸乳杆菌 +   - + # +   - + - d   - + + +   - - - +   - + - +   - - - d   - + + 注：d——有些菌株阳性，有些菌株阴性；#——弱、慢或阴性。   表3 产乳酸的链球菌的鉴别表   生长试验 加热60℃ 30min 水解 淀粉 水解 精氨酸 10℃ 45℃ 0.1% 美兰牛乳 6.5% 氯化钠 40% 胆汁 pH 9.6 嗜热链球菌 乳链球菌 乳脂链球菌 - + + + - - - + d - - - - + + - - - + d d + - - - + - 注：d——有些菌株阳性，有些菌株阴性。         附录A 数种专用培养基及试剂 （补充件）   A1 改良TJA培养基（改良番茄汁琼脂培养基） A1.1 成分 番茄汁 50mL 酵母抽提液 5g 肉膏 10g 乳糖 20g 葡萄糖 2g k2HPO4 2g 吐温80 1g 乙酸钠 5g 琼脂 15g 水加至1000mL pH6.8±0.2 A1.2 制法 番茄汁的制作：将新鲜番茄洗净，切碎（切勿捣碎），放入三角烧瓶，置4℃冰箱8~12h，取了后用纱布过滤即成。如一次使用不完，可将其置入0℃冰箱，可保存四个月。使用时让其在常温下自然溶解。 制法：将所有成分加入蒸馏水，加热溶解，校正pH6.8±0.2。分装烧瓶，高压灭菌121℃15~20min。临用时加热溶化琼脂，冷至50℃时使用。 A2 改良MC培养基 A2.1成分 大豆蛋白胨 5g 牛肉浸膏 5g 酵母浸膏 5g 葡萄糖 20g 乳糖 20g 碳酸钙 10g 琼脂 15g 蒸馏水 1000mL 1%中性红溶液 5mL 硫酸多粘菌素B（酌情而加）10万国际单位 A2.2 制法 将前面7种成分加入蒸馏水中，加热溶解，校正pH6，加入中性红溶液。分装烧瓶，高压灭菌121℃15~20min。临用时加热熔化琼脂，冷至50℃，酌情加或不加硫酸多粘菌素B（检样有胖听或开罐后有异味等怀疑有杂菌污染时，可加多粘菌素B，混匀后使用）。   A3 0.1%美兰牛乳培养基 新鲜脱脂牛乳 90mL 1%美兰水溶液 10mL A4 6.5%氯化钠肉汤 肉浸液（pH7.6） 100mL 氯化钠 6g A5 pH9.6葡萄糖肉汤 普通肉汤校正pH9.6加入0.2%葡萄糖。 A6 40%胆汁肉汤 pH7.6肉浸液 60mL 葡萄糖 0.12g 牛胆汁 40mL A7 淀粉水解培养基 pH7.6肉浸液琼脂 90mL 羊血清 5mL 3%淀粉溶液 10mL A7.1 将肉浸液琼脂深化。 A 7.2 待冷至50℃左右以无菌操作加入淀粉溶液及无菌羊血清混合后，倾注平板。 A8 精氨酸水解培养基 蛋白胨 0.1g 氯化钠 0.5g 磷酸氢二钾 0.6g L-精氨酸 1g 1.6%溴甲酚紫酒精溶液 1.4mL 琼脂 0.3g 蒸馏水 100mL pH7.2 A9 乳酸杆菌糖发酵管 A9.1 基础成分 牛肉膏 5g 蛋白胨 5g 酵母浸膏 5g 吐温80 0.5mL 琼脂 1.5g 1.6%溴甲酚紫酒精溶液 1.4mL 蒸馏水 1000mL A9.2 按0.5%加入所需糖类，并分装小试管。 A10 七叶苷培养基 蛋白胨 5g 磷酸氢二钾 1g 七叶苷 3g 枸橼酸铁 0.5g 1.6%溴甲酚紫酒精溶液 1.4mL 蒸馏水 100mL