NYT 1467-2007 奶牛布鲁氏菌病PCR诊断技术.pdf

ICS11,220
B41
中华人民共和国农业行业标准
NY/T1467~2007
奶牛布鲁氏菌病PCR诊断技术
PCR for diagnosis of brucellosis in dairy cattle
2007-12-18发布
2008-03-01实施
。中华人民共和国农业部发布
KY/T1467-2007
前言
目前,我国家畜布鲁氏?病的诊断主要方法包括虎红平板凝集试验、试管凝集试验、补体结合试验
乳牛全乳环状试验等血清学方法(GB/T18646-2002),没有列入病原诊断的内容。对牛布鲁氏菌病的
诊断,OIE推荐或指定的血清学诊断方法包括血清凝集试验(SAT)、补体结合试验(CFT)、酶联免疫吸
附试验(EISA);病原诊断采用常规病原分离鉴定技术,并认为PCR方法的建立为该病的诊断提供了
新的检测手段,可标准化后推广使用
本标准的附录A为资料性附录,附录B为规范性附录,附录C为规范性附录
本标准由中华人民共和国农业部提出。
本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归
本标准起草单位:中国农业科学院兰州兽医研究所
本标准主要起草人:邱昌庆、曹小安、周继章。
NY/T1467-2007
奶牛布鲁氏菌病PCR诊断技术
1范围
本标准规定了检测牛种布鲁氏菌( B abortus)套式聚合酶链反应诊断方法要求。
本标准适用于奶牛布鲁氏茵病的病原诊断、奶牛场检疫、疫情监测和流行病学调査。其他偶蹄动物
布鲁氏菡病PCR诊断可参照本标准。
2材料准备
2.1器材:PCR扩增仪、1.5mL离心管、2.0mL离心管、0.2 ML PCR反应管、水浴箱、台式高速温控
离心机、电泳仪、移液器、移液器吸管、紫外凝胶成像仪、冰箱。
2.2试剂:NET缓冲液,自配,配方见附录A; Rnase A酶、蛋白酶K、 Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液、
GNTTPS、DL2000DNA分子质量标准、无水乙醇、酚一氯仿异成醇(25:24:1)、Tris、琼脂糖、EDTA、
冰乙酸、氯化钠、溴酚蓝、二甲基苯青FF、溴化乙锭、十二烷基硫酸钠(SDS)、乙酸钠、盐酸、聚蔗糖
2.3引物:
Bp1 5,-CGT GCC GCA ATT ACC CTC-3
Bp2 5'-CCG TCA GCT TGG CTT CGA-3
Bp3 5,-GAT GCT GCC CGC CCG ATAA-3?
Bp4 5,-GCA CCG AGC GAG CCT TGA AA-3
引物在使用时用灭菌双蒸水稀释为50pmol/L。
2.4被检材料:奶牛新鲜原乳、流产母牛乳汁流产母牛阴道分泌物、血液(血清)、流产胎儿胃液、种公
牛精液。布鲁氏菌病疑似病例病料采集和运输注意事项见附录B
2.5布鲁氏菌总DNA的提取。
2.5.1原乳乳样中布鲁氏菌总DNA的提取方法。
2.5.1.1在室温下溶解冻存乳样(乳样长期保存应置于-20℃C,当日检测可置于4℃),取500pL奶样
于2mL离心管中,加入100LNET缓冲液。
2.5.1.2加入100kL-20%的SDS(终浓度3.4%),混匀。在95℃~100℃孵育10min后,迅速放置于
冰上冷却10min~15min
2.5.1.3在样品中加人 Rnase A酶至终浓度为75g/L,50℃作用2b。然后加入蛋白酶K至终浓度
为325g/pL,50℃作用2h
2.5.1.4在消化液中加入等体积的酚氯仿一异戊醇(25:24:1),颠倒2次~3次,摇匀,4℃下
7000r/min离心10min
2.5.1.5移上清液于另一离心管中。
2.5.1.6重复2.5.1.4、2.5.1.5操作过程,加入2.5倍体积的预冷无水乙醇,一20℃沉淀30min
12000r/min离心10min,弃去所有液相
2.5.1.7用1mL70%乙醇漂洗,12000r/min离心2min,重复2次~3次
2.5.1.8真空或室温干燥,DNA沉淀物用25gL无菌双蒸水溶解作为模板,保存在一20℃备用。
2.5.2血液中布鲁氏菌总DNA的提取
2.5.2.1血液分离血清。
NY/T1467-2007
2.5.2.2布鲁氏菌总DNA的提取方法同2.5.
2.5.3胃液中布鲁氏菌总DNA的提取
胃液中布鲁氏菌总DNA的提取方法同2.5.
2.5.4流产母牛阴道分泌物中布鲁氏菌总DNA的提取
2.5.4.1用NET缓冲液2mL沖洗棉签蘸取的流产母牛阴道分泌物
2.5.4.2牛阴道分泌物中布鲁氏菌总DNA的提取方法同2.5.1
2.5.5流产胎衣中布鲁氏菌总DNA的提取
2.5.5.1取病变明显的一小块流产胎衣剪碎或刮下黏膜层,将碎组织块或黏膜层置于2mL离心管中,
加入400 PLNET裂解缓冲液(pH7.6
2.5.5.2胎衣中布鲁氏菌总DNA的提取方法同2.5
2.5.6公牛精液中布鲁氏菌总DNA的提取
2.5.6.1取100pL精液,加入500LNET裂解缓冲液(pH7.6)。
2.5.6.2公牛精液中布鲁氏菌总DNA的提取方法同2.5.1
3PCR试验
3.1反应体系
第一次PCR扩增:
10 X PCR buffer(含Mg2+
脱氧三磷酸核苷酸混合液( DNTPS)
4 WL
BP1和BP2引物
各1L
模板(被检样品总DNA)
无薗双蒸水
34.75
Taq DNA聚合酶
0.25以L
第二次PCR扩增:
10 XPCR buffer(含Mg2+
5 UL
DNT Ps
BP3和BP4引物
各1L
模板(一扩产物)
无菌双蒸水
Tag DNA聚合酶
0.25L
样品检测时,同时要设阳性对照和空白对照,阳性对照模板为布鲁氏菌mp25阳性质粒,空白对照
为双蒸水
3.2反应程序
第一次PCR扩增:首先95℃变性5min,然后35个循环;分别为:94℃变性1min;49℃退火
72℃延伸1min。最后72℃延伸10min
第二次PCR扩增:20个循环,分别为:94℃变性30s:51℃退火1min;72℃延伸1min。最后72℃
延伸6min。
3.3电泳
3.3.1制板
1%琼脂糖凝胶板的配方和制备,将1g琼脂糖放入100 ml TAE电泳缓冲液中,加热融化。温度
降至60℃左右时,加人10mg/mL溴化乙従(EB)3gL~5L,均匀铺板,厚度为3mm~5mm。