GBT5009.95-2003 蜂蜜中四环素族抗生素残留量的测定.pdf

ICS67.040
GB
中华人民共和国国家标准
GB/T5009.95-2003
代替GB/T13110-1991
蜂蜜中四环素族抗生素
残留量的测定
Determination of tetracyclines residues in honey
2003-08-11发布
2004-01~-01实施
串雄犯晏绩変发布m
GB/T5009.95~-2003
前言
本标准代替GB/T13110-199《蜂蜜中西环素族抗生素残留量的测定方法
本标准与GB/T13110-1991相比主要修改如下:
修改了标准的中文名称,标准中文名称改为《蜂蜜中四环素族抗生素残留量的测定》
按GB/T20001.4-2001《标准编写规则第4部分:化学分析方法》对原标准的结构进行
了修改
本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。
本标准起草单位:福建省食品卫生监督检验所、福建省药品检验所。
本标准主要起草人:林升清、马赛骏、黄宏南、耿莹莹、林桂生
原标准于1991年首次发布,本次为第一次修订。
GB/T5009.95~2003
蜂蜜中四环素族抗生素残留?的测定
范围
本标准规定了用微生物管碟法测定蜂蜜中四环素族抗生素残留量的方法。
本标准适用于天然或加工蜂螢中四环素族抗生素残留量的测定。
原理
试样中四环素族抗生素经 Mcllvaine缓冲液提取后,用SEP-PAKC1s柱纯化。四环素族三种抗生
素四环素、土霉素及金霉素利用薄层层析生物检测法进行分离和定性;以蜡样芽胞杆菌为试验菌株,用
微生物管媟法进行定量检测
3试剂
3.1 Mcllvaine缓冲液(pH4):称取磷酸氢二钠(Na2HPO4?12H2O)27.6g、柠檬酸(CH2O,?H2O)
12.9g、乙二胺四乙酸二钠37.2g,用水溶解后稀释并定容至1000mL。
3.20.1mol/L礫酸盐缓冲液(pH4.5):称取磷酸氢二钾13.6g,用水溶解后稀释并定容至1000mL。
115℃灭菌30min,置4℃冰箱中保存。
3.3乙二胺四乙酸二钠水溶液(50g/L)。
3.4 Waters SEP-PAKC:柱(或国产PTC3柱):用时先经10mL甲醇滤过活化,再用10mL蒸馏水
置换,然后用10mL50g/L乙二胺四乙酸二钠流过
3.5抗生素标准品:四环素、土霉素、金霉素标准品(由卫生部药品生物制品检定所提供)。
3.6抗生素标准溶液:
3.6.1抗生素标准原液的配制:准确称取四环素、土審素、金素标准品适量(按效价进行换算),用
0.01mol/L盐酸溶解并定容至1000g/mL,置4℃冰箱中(可使用7天)。
3.6.2抗生素标准稀释液配制:临用前取上述原液按1:0.8剂距用0.1mol/L磷酸盐缦冲液逐步稀
释配制成标准稀释液。制备四环素、土莓素标准曲线的标准浓度为0.16,0.21,0.26,0.32,0.40,
0.50gg/mL,参考浓度为0.25g/mL;制备金霉素标准曲线的标准浓度为0.033,0.041,0.051,0.064,
0.080,0.100gg/mL,参考浓度为0.050μg/mL。定性试验用标准液浓度四环素、土霉素为2g/mL,
金素为1pg/mL。
3.7展开剤:正丁醇-乙酸-水(4+1+5)
4伩器
隔水式恒温箱
4.2冰箱:O℃~4℃C
4.3恒温水浴。
4.4高压灭菌器。
4.5旋转式减压蒸馏器。
4.6离心机:2000r/min。
4.7天平:感量0.1mg。
4.8层析缸:内长20cm、宽15cm、高30cm。
4.9长方形培养皿:1.5cmX8cm×23cm。
GB/T5009.95-2003
4.10层析纸7cm×22cm,中速滤纸
4.11微量注射器:10pL、50gL。
4.12电吹风机。
4.13游标卡尺。
4.14吸管:容量为1mL.和10ml,标有0.1mL单位刻度
4.15注射器:容量为20mL。
4.16平皿:内径为90mm,高16mm~17mm,底部平整光滑,具陶瓷盖。
4.17不锈钢小管(简称小管):内径6.0mm士0.1mm,外径7.8mm土0.1mm,高度10mm
5培养基
5.1菌种培养基
胰蛋白胨
牛肉浸膏
氯化钠
g
琼肚
14g~16g;
蒸馏水
1000mL。
将上述各成分混合于蒸馏水中,搅拌加热至溶解,110℃灭菌30min,最终pH值为7
5.2检定用培养基:
胰蛋白胨
牛肉浸膏
磷酸氢钾
3.0g
琼脂
14~16g
蒸馏水
将上述各成分混合于蒸馏水中,搅拌加热至溶解,110℃灭菌30min,最终pH值为6.5士0
6试祥处理
6.1定量试验用样液制备:称取混匀的蜂蜜试样10.0g,加入30mLpH4.0的 Mcllvaine缓冲液,搅拌
均匀,待溶解后进行过滤,滤液分数次置于注射器中,用经预处理的SEP- PAK C187柱滤过,用50mL水洗
柱,再用10mL.甲醇洗脱,洗脱液经40℃减压浓缩蒸干后,准确加入pH4.5磷酸盐缓冲液3mL~4ml
溶解,备定量检测用。
6.2定性试验用样液懰备:称取蜂蜜试样5g,按6.1步骤处理,甲醇洗脱液经40℃减压浓缩蒸干后,
用0.1mL甲醇溶解,备定性试验用。
7菌液和检定用平板的制备
7.1试验菌种:蜡样芽胞杆菌( Bacillus cereus var. m es),菌号63301,由卫生部药品生物制品检
定所提供,
7.2菌液的制备:将菌种移种于盛有菌种用培养基的克氏瓶内,于37℃培养7天,使镜检芽胞数达
85%6,先用10mL灭菌水洗下菌苔,离心20min,弃去上清液,重复操作一次,再加10mL灭菌水于沉淀
物中,混匀。然后,将此芽胞悬浮液置65℃恒温水浴中加热30min。从水浴中取出,于室温下放置
24h,再于65℃恒温水浴中加热30min,待冷后置4℃冰箱保存。用时可取此芽胞悬液以灭菌水稀释
10倍成稀菌液。
7.3芽胞悬液用量的测定:把不同量的稀菌液加入检定用培养基中,按本法进行操作,0.25g/mL的
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