GB-T 19440-2004 禽流感病毒NASBA检测方法.pdf

免费标准网(ww. freeby.ne)标准最全面
ICS11.220
中华人民共和国国家标准
GB/T19440--2004
禽流感病毒 NASBA检测方法
Protocol of detecting avian influenza virus using NASBA
2004-02-14发布
2004-02-15实施
中华人民共和国国家质量嗌督检验检疫总局
中国国家标准化管理委员会发布
免費标准网(w. freeby.net)无需注册即可下载
免费标准网(ww. freeby.ne)标准最全面
GB/T19440-2004
前言
禽流感由正粘病毒科流感病毒属中A型流感病毒引起,其中高致病性禽流感因其传播快、危害大
世界动物卫生组织(OIE)将其列为A类疾病,我国将其列为一类动物疫病。
依赖核酸序列的扩增技术( NASBA)检测禽流感病毒的敏感性与经典的鸡胚病原分离方法相当,并
具有检测速度快、特异性强、与鸡胚病原分离方法符合率高、易于操作的特点。
本标准是在综合我国科研成果的基础上,参考OIE《诊断试验和疫苗标准手册》(2000年版),并结
合我国现有动物卫生法规及农业部对禽流感的相关政策和措施制定的。
本标准附录A、附录B、附录C为规范性附录,附录D为资料性附录。
本标准由上海市质量技术监督局和中华人民共和国上海出入境检验检疫局提出
本标准由国家质量监督检验檢疫总局归口
本标准起草单位:中华人民共和国上海出人境检验检疫局、上海市质量技术监督局、香港基因晶片
开发有限公司
本标准起草人:单松华、刘乐庭、倪旦红、胡永强、李树清。
免費标准网(w. freeby.net)无需注册即可下载
免费标准网(ww. freeby.ne)标准最全面
GB/T19440~-2004
禽流感病毒 NASBA检测方法
范
本标准规定了 NASBA快速检测禽流感病毒技术规范的材料准备、操作方法和结果判定。
本标准适用于禽类、禽肉产品中所有亚型禽流感病毒的快速检测、诊断。
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有
的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究
是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。
GB/T18936-2003高致病性禽流感诊断技术
3原理
NASBA( Nucleic acid sequence-based amplification, NASBA,依赖核酸序列的扩增技术)是一项连
续、等温、基于酶反应的核酸扩增技术。该技术使用三种酶(反转录酶、核糖核酸酶H、噬菌体T7核糖
核酸聚合酶)和两条寡核苷酸引物。上游引物5'末端含有噬菌体T7的依赖于DNA的RNA聚合酶的
启动子序列,下游引物的5'末端含有和钌标电化学发光检测探针互补的序列。在扩增步骤中,两个5
端都整合进扩增序列中,这样既成为产生互补RNA序列的模板,又能特异性结合检测步骤中的ECL
探针。扩增底物与ECL探针形成复合物,携带该复合物的磁珠被电极的表面磁性捕获。电极上的电压
引起电化学发光(ECL)反应。已杂交上的钌标磁珠发出的光和扩增反应产生的RNA扩增产物总量成
比例对应。
4材料准备
4.1试验环境
干净的环境,最好分区。分为核酸提取、核酸扩增和核酸检测三个区。
4.2器材
采用常规的分子生物学器材,包括:一次性手套、移液器(量程5L到200gL)、枪头、无RNA酶的
5mL塑料离心管、1.5mL离心管架、5mL试管架、旋涡振荡器、计时器、高速台式离心机、温度计(精
度士2℃)、加热器、水浴锅、5mL聚丙烯试管(VWR)、封口膜
如果采用ECL方法,需要 Nuclisens阅读器或者其他等同仪器。
如果采用 ELISA方法,需要酶标仪。
4.3引物
上游引物 AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAGAAGGA(A/G) G GCA TT(C
TTGG ACAAA(G/T) CGT CTA
下游引物 GAT GCA AGG TCG CAT ATG AGG AGA CTT TA ACC GAG GTC GAA ACG
TA
4.4检測试剂
所有检测试剂在使用前,使其达到室温。
a)裂解缓冲液:5mol/L异硫氯酸胍,10% Triton X-100,10mmol/ Ltris-HCl,pH8.3;
b)冲洗缓冲液:5mol/L异硫氰酸胍,10mmol/I.Tris-HCl,PH8.3;
免費标准网(w. freeby.net)无需注册即可下载
免费标准网(ww. freeby.ne)标准最全面
GB/T19440-2004
c)500mg/mL硅土:500mg/mL盐酸活化的二氧化硅;
d)洗脱缓冲液:10mmol/ L Ttris-HCl,pH8.3;
e)酶溶液(参见附录A)
f)捕捉探针:10mmol/L生物素化寡聚核苷酸;
探针序列为 Biotin- CCG TCA GGC CCC CTC AAA GCC GA
g)电化学发光法属别检测探针(10 mmgeneric ECL detection probe):钌标记的DNA寡聚核
苷酸;
ECL序列为 GAT GCA AGG TCG CAT ATG AG CTT CTA ACCGAG GTC GAA ACG TA
h)仪器调试参照液:10mmol/ L NASBA CP;1mmol/ L Tris- HCI PH8.3;3mmol/L
NASBA-ECI
i)检测稀释液:15mmol/ LTRIS-HCI,pH8.3;
)分析缓神液:50mmol/ Ltris-HCl,pH8.3;1×PBS(137mmol/LNaC,2.7mmol/LKCl,
10 mmol/L Na2 HPO,, 2 mmol/L_ KH2 PO,)
k)清洗液:100mmol/LKOH,10%SDS,10% Triton X-100;
1)无水乙醇 alcohol。
4.5样品采集、保存、处理
按GB/T18936-2003中2.1进行
5操作方法
核酸释放和提取
按以下顺序:
a)将0.1mL样品加入盛有0.9mL裂解缓冲液的管中并振荡混合;
b)振荡混合硅土悬浮液并向每个管中加人50pL;
振荡混合均匀
d)室温下温育10min(每2min振荡混合一次,防止硅土沉淀);
e)在12000r/min下离心裂解缓冲液管30s;
f)小心移除上清液(不要搅动沉淀)后,向每个管中加人1mL冲洗缓冲液;
g)振荡混合直至管中沉淀重新完全悬浮为止;
h)在12000r/min下离心30s,然后移除上清液
i)重复第)步到第h)步的步骤。依次为一次使用冲洗缓沖液;两次使用70%乙醇;最后一次使
用100%乙醇;
j)最后一次洗涤步骤后,用移液器小心移除残余乙醇;
k)使用加热器在56℃敞口干燥硅土10min《用薄纸袛盖每个管避免污染);
1)干燥后向每个管加入50L洗脱缓冲液;
振荡试管直至沉淀物再次重新完全悬浮
n)56℃温育硅土悬浮液10min以洗脱核酸(5min后开始振荡试管);
在1200