碲化镉纳米晶标记抗荧蒽抗体及其荧光免疫分析.pdf

第38卷
分析化学( EENXI HUAXUE)研究简报
第3期
2010
年3月
Chinese Journal of Analytical Chemistry
385~388
DOI:10.3724/SP.J.1096.2010.0385
碲化镉纳米晶标记抗荧蒽抗体及其荧光免疫分析
叶其炎庄惠生“12王琼娥张金艳周纯1
(东华大学环境科学与工程学院,上海201620)2(上海交通大学环境科学与工程学院,上海200240)
摘要以水热法合成的碲化镉(CdTe)纳米晶标记抗荧蔥抗体后,标记复合物的荧光强度增强,其分散性和
稳定性良好。将此标记物用于直接竞争荧光兔疫分析,测定了环境水样中荧蔥的含量。结果表明,在0.1
1000pg/L范固内有良好的线性关系;抑制率IC为12.4pugL,检出限IC如为13.1ng/L。对水样进行加标
回收实验,回收率在95.1%~111%之间;相对标准偏差小于9%。本方法确可靠,结果满意,能够满足环
境中微量环境激素类污染物的检测需要
关键词碲化镉;荧蒽;直接竞争;光免疫分析
1引言
荧蒽是·种含3个苯环的多环芳烃(PAHs)环境激素类有机污染物。煤、石油、天然气、有机高分子
化合物和许多碳氢化合物等在不完全燃烧时,都能生成荧蒽等多环芳烃类物质,该类物质对人类和环境
均能造成危害2。美国环保局已将包括荧蔥在内的16种多环芳烃列为优先控制污染物,并作为环境
监测必检项目。因此,对荧蒽等多环芳烃类污染物的监测分析已成为环境监测的热点之
目前,检测PAHs最常见的方法是气相色谱法和高效液相色法。但是,这些方法的前处理过程复
杂且耗时,其检出限和线性范围有限,限制了该类方法的广泛应用。近年来,免疫分析技术被引入环境
监测领域并显现出良好的应用前景31,它具有方便快捷、检测成本低、灵敏度高等优点。其中荧光标
记免疫分析方法应用于环境激素有机污染物的检测已引起了广泛关注S7?。
纳米粒子具有的尺寸效应,使其可依据分子的大小而晁示不同的光谱特征,能实现对不同物质的标
记,而且光强度大、光稳定性高、谱线宽度?。以这些特姝材料为标记物,可显著提高分析方法的
灵敏度和分辨率,同时对生物大分子的活性影响较小
以碲化镉(C:dTe)纳米子替代一-般荧光染料作为荧光标探针,应用于环境激素荧蒽的检测分析
还未见报道。本研究以自制ClTe纳米晶"标记自制的荧蒽抗体,建立了直接竞争荧光免疫检测法
FILA)。用于检测环境中微量削环境溦素类有机污染物荧蒽,结果可靠满意,为检测环境屮多环芳烃类
有机污染物提供了一种新的方法
2实验部分
2.1仪器与试剂
TU-1900双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器公司);970CRT荧光分光光度计(上海分
析仪器总厂);Fx-800酶标仪(美国BIO-TYEK公司);96孔荧光酶标板(基因有限公司)
荧蒽人工抗原与抗体(白制)2;功能性纳米晶CdTe(自制》);禁、菲、荧蒽和蔥的标准品(百灵威
公司);卵清蛋白(OVA,上海华美生物制品公司);吐温-20(上海化学试剂公司);DM27m透析袋(上
海奔大生物科技公司);水为超纯水;其它试剂均为国产分析纯。
2.2CdTe标记抗体
取1.5mL功能性Cdre纳米晶于试管中,向其中加入50pL0.10mol/L1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基
碳二亚胺盐酸盐(E.DC-HC1)和50ルL0.10moV/LN羟基丁二酰亚胺(NHS),室温放置15min后,加人
2009-0707收稿;2009-10-15接受
本文系国家自然科学基金(N.2067708)、教育部高等学校博士点创新基金(No.2006025504)、上海市重点学科基金(No.B604)和
东华大学博土创新基金(Na.BC200832)资助项目
*E-mail:huishengzhuan@126.com
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分析化学
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2.0mL抗荧蒽抗体(1.4gy/L),于4℃反应48h,用磷酸盐缓冲溶液(PBS)透析完全后,于4℃冰箱保存。
2.3直接竞争荧光免疫实验
在方阵实验中,以空白吸收值最低,荧光强度较好,抗原抗体结合反应抑制率高,线性关系好的实验
条件组合建立标准曲线。实验步骤如下:(1)包被:以0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释包被抗
原至工作浓度,100Lレ孔加至酶标板,4℃过夜;(2)封闭:将包被好的板取出,待其恢复至室温,用含
0.05%(Vの吐温-20的磷酸盐缓沖液(PBS)洗涤3次。加人1%OVA封闭,200p/孔,37℃温育
0.5h;(3)加样:将封闭好的板取出,待其恢复至室温,PBST洗涤3次。每孔依次加入50.经磷酸盐
缓冲液(PBS)稀释的系列浓度的荧蒽标淮溶液和50L经PBST稀释的Cdre标记抗体,对照孔加入
50 UL PBS和50 HL Cdte标记抗体,37℃温育1h;(4)测定:将温育好的板取出,PBST洗涤5次。用荧
光酶标仪测定荧光强度值F;(5)恨据抑制率对荧蒽浓度作图,得到荧蒽的称准抑制曲线,对线性范围
进行相关分析,得出线性回归方程,并计算抑制中浓度IC0和20%抑制时浓度IC2の。
结果与讨论
3.1功能性纳米晶CdTe的荧光光谱和紫外吸收光谱
修饰了巯基乙酸的CdTe及其标记抗体的荧光光谱如图1所示,激发波长687nm。从图1可见,连
上抗体以后荧光明显增强,发射光谱发生蓝移,但半峰宽基本不变,表明在标记过程中,CdTe粒子之间
没有发生团聚,分散性较好。可能是在交联剂的活化作用下,通过酰胺键实现CdTe表面的羧基与抗体
上氨基的共价链接,使得CdIe的表面电荷减少,降低了Clre周围分了的定向极化率,使其 Stokes位移
减小,并且形成类似于(CdTe),(FL),的核壳结构,所以荧光强度増加23:,发射光譜发生蓝移(
修饰了巯基乙酸的CdTe及其标记抗体的吸收光谱如图2所示。CdTe在400mnm处有吸收,可以看
到向巯基乙酸修饰的CdTe中加人适量抗荧蒽抗体反应后,体系的吸收强度明増大,而且最大吸收峰
发生蓝移。从图2可见,与筑基乙酸修饰的 Cdte溶液为空白对比分析,在280nm处可以明显看到
CdTe-抗体复合物的特征吸收峰,表明CdTe已经链接上抗体3l
Cdte-anti-fl-ab
5.0r
Cdte-anti-fi -ab
「r.
640
Wavelengthinm
んm
图1 Cdte功能性纳米晶及其标记抗体的荧光光谱
图2CdTe功能性纳米晶及其标记抗体的吸收光谱
Fi
Fig. 2 Absorption spectra of Cdte and (Dte-anti-fl-abx
ethene-anlibody(cutc-anli-fl-ab)
3.2CdTe-荧蒽抗体结合比率的測定及其稳定性分析
F/P值代表荧光标记物与蛋白质的结合比率。F/P值越高,说明抗体分子上结合的荧光素越多,反
之则越少。比值过低敏感性差;比值过高易出现非特异性反应。一般要求标记gG,FP比值在1~5
为合适。以紫外分光光度计分别于280nm(貨白质特异吸收峰)和400nm(标记Cde的特异吸收
峰)测定制备的荧光标记抗体的吸光度,按式(1)计算得到的F/P值为2.7,满足要求c
/(A38-0.35A
将制得的CTe-ni-FI-alb标记试剂于4℃放置15d后