聚二甲基硅氧烷芯片自由酶反应器检测葡萄糖.pdf

第38卷
分析化学( FENXI HUAXUF)研究快报
第6期
2010年6月
Chinese Journal of Analytical Chemistry
767~770
-い=い-
研究快报
DOI:10.3724/SP.J.1096.2010.00767
聚二甲基硅氧烷芯片自由酶反应器检測葡萄糖
仲海燕周洁余晓冬”陈洪渊
(南京大学化学化工学院生命分析化学教育部重点实验室,南京210093)
摘要应用电泳中介微分析(EMMA)技术,构建聚二甲基硅氧烷(PDMS)芯片自由酶反应器,在线检测葡
萄糖(Clu),在十字形的芯片通道上,采用自制的碳纤维微电极检測葡萄糖氧化晦(GOD)催化氧化Clu生成
的H2O2,并对检测电位、COD浓度、COD进样时间、分离电压等参数进行了优化,测定了该自由酶反应器的线
性范闱和检出限,考察了其重现性及稳定性。结果表明,此自由酶反应器制作方便,操作简单,重现性好
Clu浓度在0.1~20mmol/L之间有较好的线性关系(r=0.997),检出限为19.8umoL(S/N=3)。
关键词自由酶反应器;葡萄糖;电泳中介微分析;聚二甲基硅氧烷芯片
引言
近年来,基于酶催化反应的微流控芯片备受关注。它们将酶的高效性、高选择性以及信号放大性与
芯片的高通量、低消耗、分析速度快以及高度集成化等特点相结合,为化学分析、医药研究、蛋白质组学
和生物工程等领域的研究提供了强有力的研究平台
日前已发展了多种类型的微流挖芯片酶反应器,根据芯片中酶的存在形式,可分为自由酶反应器和
固定化酶反应器。固定化酶反应器能使酶的稳定性提高,减少酶的消耗,可重复使用,不会干扰产物的
分离检测(-8,目前,区域化固定酶的方法主要有光附着法?、光聚合法0,)、微珠固定法2、原位合成
金纳米粒子法"]等,这些方法中酶在芯片通道内的固定步骤比较复杂,耗时。相比而言,自由酶反应器
貝有更好的灵活性,制作方使,操作简单。Wang等?在芯片上集成了葡萄糖(Glu)和乙醇与其对应的
葡萄糖氧化嗨(GOD)和脱氢晦的柱前反应,并以此实现了上述两种物质的同时检测。采用类似的方法
他们还在微流控系统上实现了Gu、尿酸和抗坏血酸的电化学同时检测5。 Hugel等?使用微流控芯
片对一种具有重要临床意义的酶一一亮氨酸氨肽酶(LAP)的动力学性质进行了研究
本研究将微流控芯片技术和电泳中介微分析(EMMA)技术相结合,构建了简便的Glu自由酶反
应器,通过电化学检测COD催化氧化Gu生成的H2O2,实现了Glu的在线检测。
2实验部分
2.1仪器与试剂
CHI660C(上海辰华电化学仪器有限公司),自制高压电源,碳纤维(d=8pm, Goodfollow Co
Oxford,UK)。
Sylgard184型PDMS预聚体及固化剂( Dow Corning, Midland,MI,USA),Glu(国药集团化学试剂有
限公司),COD(美国 AMRESCO公司),Na2HPO2(南京化学试剂一厂)。20mmol/L.磷酸盐缓冲溶液
(PBS,pH7.0,以0.22m的混合纤维树脂孔滤膜(上海新亚净化器件厂)过滤)。Gu溶液,GOD溶液
均由20mmol/LPBS缓冲溶液配制。所用试剂均为分析纯。PDMS芯片水平放置在自制的集成有精密
三维调节架(上海联谊光纤激光仪器厂)的有机玻璃底座上,如图1。
201001-28收稿;2010-03-20接受
本文系国家自然科学基金创新群体新项目(No.20821063),973项月(No.2007CB714501),863项目(いo.2007A022001)资助
E-mail:yux(@nju.edu.cn
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分析化学
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2.2PDMS芯片及电极制作
十字通道的PDMS芯片直接由模具浇铸法制
HV
成。含反转通道的硅模板由南京大学电子系制作。
模板进样通道平均宽度为30m,深18m。分离
WE
通道呈梯形,宽度平均为50m,深18gm,长4cm。
PS
PDMS预聚体和固化剂按质量比10:1混合,除气后
F
倒在模板上,在80℃固化2h后取出,待冷却后从模
板上剥下含分离通道的PDMS芯片,用刀切割成所
图1PDMS/PDMS微芯片分析系统示意图
需形状。在样品池、样品废液池和缓沖溶液池处打Fg1 Schematic diagram of poly( dimethylsiloxane
直径2m的孔。在一个玻璃模板上用同样方法制(PwS)/ PDMS microanalysis system
得不含分离通道的PDMS盖片。两种PDMS薄片分wE:碳纤维T作电极( Carbon fiber cylindrical electrode):CE:对
别用丙酮、甲醇、水超声洗涤各20min,在红外灯下电极(P1 counter electrode);RE:参比电极(Ag/ Agcl reference
烘干,用氧等离子体处理后封合待用。
electrode);CE:接地电极( Pt ground electrode);PS:恒电势器
单根碳纤维柱电极的制作方法:用多功能玻离(Puiu):N商(ゅnu):P:电放" ersonal com
uter);A:G加溶液池( Clucose solution reservoir);B:工作电极
微电极拉制仪将内径500μm的玻璃毛细管拉制
在管内部分( The tip of WE in channel);C:通道门( Channel
成尖端直径约50m的徴管。在显微镜下,将单ouea):D:玻璃毛细管( The tip of glass capilla)E:COD溶液
根碳纤维(直径8um)穿人毛细管尖端中,用快速池( Glucose oxidase solution reservoir);:F:废液池( Waste reser
胶封口。风干后,在毛细管的另一端装人碳粉,然ir):BC=40m;BD=2mm:AE=EC=F=0.5cmi
后用铜丝将碳粉塞紧,在屁微镜下将碳纤维电极的C=3,5cm通道深( Depth of all channe:1m:进样通道
宽( Width of sampling
分离通道宽(Widt
尖端切到1.5mm长,形成碳纤维柱电极。碳纤维
separation channel ): 50 um
柱电极于缓冲液中在+1.5和-1.0V下分別活化
200s可以得到较好的安培响应。采用三电极系统检测,Ag/Agl为参比电极,Pt电极为对电极。将活
化好的碳纤维柱电极,在显微镜下从分离通道出口处放人通道内,工作电极的尖端距离出口约40um。
电化学检测采用“ Amperometric i- t curve”模式。所有实验均在室温下进行
2.3电泳方法
在分离通道A池中加入适量Cu溶液,加样通道F池加入100U/ ml GOD溶液,F和C端加电压
进样,A和C端加电压分离,采用碳纤维微电极检测Gu在线酶反应生成的H2O2。
3结果与讨论
I10
3.1Gu在线酶反应的EMMA平台峰
在氧等离子体封合的“十”字型PDMS芯片上进行
COD催化氧化Glu的在线自由酶反应,得到的EMMA
电泳图如图2所示。
Clu和H202是中性分子,其迁移速度与电渗流相
l60
同,而COD等电点为