DB21∕T 2396-2015 水稻品种抗稻瘟病基因检测 PCR法.pdf

ICS65.020.0
B04
1DB21
辽宁省地方标准
DB21/T2396-2015
水稻品种抗稻瘟病基因检测PGR法
2015-05-18发布
2015-07-18实施
辽宁省质量技术监督局发布
DB21/T2396-2015
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。
本标准由辽宁省衣业科学院提出.
本标准由辽宁省农村经济委员会归口。
本标准由辽宁省农业科学院创新中心负责起草。
本标准主要起草人:陆晓春、郑文静、丛玲、赵家铭、王妍、张丽霞、自春明、王春语、朱振兴、马丽
李丹、王平、李金红等。
本标准由辽宁省农业科学院创新中心负责解释
DB21/T2396-2015
水稻品种抗稻瘟病基因检测PCR法
范围
本标准规定了检测水稻品种抗稻瘟病基因的PCR检测法,包括原理、仪器设备、试剂和材料、防
污染措施、实验步骤及结果分析。
本标准适用于水稻品种中抗稻瘟病基因pita、pid2、pid3、pik、pikp、 pikm、piks、pi21、pi36、pi37
和piS的检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T19495.2转基因产品檢测实验室技术要求
衣业部1485号公告-4-2010转基因植物及其产品成分检测DNA提取和纯化
术语及缩略语
下列术语及缩略语适用于本标准
3.1正向引物:处于DNA双链上游的引物,简称下引物。
3.2反向引物:处于DNA双链下游的引物,简称R引物。
3.3内参引物:在聚合作用起始时,可以刺激合成另一种大分子,并与反应物以共价键形式连接的序
3.4UNA: Deoxyribonuc I cic acid,脱氧核糖核酸。
3.5 PRIMCSTAR HS DNA Pol ymcrasc:高保真DNA聚合酶
3.6 PRIMESTAR Buffer(5x):5xPCR反应液
3.7 DNTP Mi xture(10mML):单核苷酸混合液(10mM)。
3.8 PCR: Polymerase chain reaction
3.9TAE: Iris-cl、冰醋酸、IDTA缓冲液。
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3.10 Goldenview:核酸染料,替代溴化乙锥。
3.11 DNA Marker:标准分子量的核酸标记。
3.12bp: Basc pair,碱基对。
3.13Tris:tris( hydroxyl thy I) aminoe than,三羟甲基氨基甲烷。
4原理
根据水稻抗病基因保守区序列设计特异性州物,提取不同水稻品种的DNA,对试样进行PCR扩增,
依据是否扩増获得预期大小的DNA片段及特定的序列来判断样品是否携带该抗病基因。
5仪器设备
5.1台式离心机
5.2PCR仪。
5.3凝胶成像系统。
5.4琼脂糖电泳槽及电泳仪等电泳装置。
5.5恒温水浴锅。
5.6分析天平:感量0.1g、0.01g和0.1mg。
5.7具盖塑料离心管:2ml,0.2ml.
5.8研钵、研杵。
5.9移液枪和吸头:1000uL,200pL,10uL
5.10其它相关仪器设各
6试剂和材料
6.1供试水稻叶片或种子。
6.2DNA提収试剂盒。
6.3 PRIMESTAR IIS DNA Pol ymerase.
6.4 PRIMESTAR Burrer(5x)
6.5 DNTP Mixture (LONM)
6.6 DNA Marker:可以清楚地区分100bp~1000bp的DNA片段。
6.750xTA缓冲液,使用时稀释50倍
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6.8加样缓冲液
6.9引物见附录A。
除非另有说明,仅使用分析纯试剂和重蒸馏水或符合GB/T6682规定的一级水。
7防污染措施
检测过程中防止污染的措施按照GB/T19495.2中的规定执行。
8实验步骤
8.1水稻DNA提収
按农业部1485号公告--4-2010的规定执行。
8.2PGR反应
8.2.1将试样DNA、 PRIMCSTAR Buffer(5x)、 DNTP Mixture、正向引物及反向物及dH_O)置于冰
上.融化。
8.2.2在0.2m.加盖无菌离心管中,按先后顺序加入
PRIMESTAR Bufer(5×
6 WL
DNTP Mixture(2. 5 MM)
2.4
正向引物及反向引物(100mM)
0.2pL(终浓度:0.2uM~0.3pM),
试样DNA
L(20~100ng)
PRIMESTAR HS DNA Polymerase (2.5U/UL) 0.3 ul
用移液枪拙打混匀,盖上盖子短暂离心,置于冰上待用
8.2.3将离心管置于PCR仪中,反应程序为:
95℃预变性5min,95℃变性30s,55C~61℃退火30s,,72℃延伸30s~60s(每对引物
的退火温度及延伸时问参见附录A),29个循环,72C总延伸5min,4℃保存。
8.3PCR产物电泳
8.3.1用200m.玻璃烧杯称取琼脂糖O.5g,加入1xTAE缓冲液50ml
8.3.2杯口用锡箔纸盖好,置微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。
8.3.3琼脂糖冷却至50℃左右时加入2.5ul. Gol denview,混匀,迅速将胶倒至模具中,放置上样梳。
8.3.4待胶完全凝固后,拔下上样梳,置于鑑有1×TAE缓冲液的电泳槽中。
8.3.5吸取5u.PCR反应液,与1ul.加样缓冲液混匀,上样,130v电泳0.5h~1.0h
8.3.6电泳结東后,取下琼脂糖胶,利用凝胶成像系统观察电泳条带大小,并照相
8.4PCR产物测序