糖蛋白糖基化位点及糖型的多重质谱分析.pdf

第43卷
分析化学( FENXI HUAXUE)研究报告
第4期
2015年4月
Chinese Journal of Analytical Chemistry
564~569
DOI:10.11895/ J. Issn.0253-3820.140912
糖蛋白糖基化位点及糖型的多重质谱分析
于晶2李晓敏“2李红梅张庆合2李秀琴2邵淑丽
(齐齐哈尔大学生命科学与农林学院,齐齐哈尔161006
2(中国计量科学研究院化学计量与分析科学研究所,北京100090
摘要以糖蛋白核糖核酸酶B( RNASE B)为研究对象,采用基质辅助激光解吸电离-串联飞行时间质谱
( MALDI-TOF/TOF-MS)、傅里叶变换离子回旋共振质谱(FT-CR-MS)的碰撞活化解离(CAD)和电子转移解离
(ECD)多种质谱技术对 Rnase B的糖肽的完整信息进行解析。通过多种质谱相互验证,确定了 Rnase B的糖
肽组分的氨基酸序列为 SRNLATK糖链结构为( HEXNAC)2(Hex)s-( HEXNAC)2(Hex),及糖基化位点为第34位
氨基酸残基。本方法为糖蛋白结构的全面解析提供了一种快速、有效、全面的研究思路。
关键词基质辅助激光解吸电离-串联飞行时间质谱;傅里叶变换离子回旋共振质谱;碰撞活化解离;电子
捕获解离;核糖核酸酶B
引言
蛋白质的糖基化是糖链在糖基转移酶作用下结合到蛋白质特定氨基酸残基上,是蛋白质的一种
重要的翻译后修饰方式2。目前,已知哺乳动物蛋白质中至少有1/2是糖蛋白,广泛分布于各种组织
和细胞中。糖蛋白糖链的结构多样,功能复杂,并且由于生物合成的非模板性和结构的微不均一性,
使糖链具有了更多的分支结构、连接方式和空间构象,因此,修饰后的糖蛋白会产生多种生物活性,对生
物体的生长、发育甚至对生物体的生存起着至关重要的作用り。蛋白质的糖基化类型主要为M连接和
の-连接的糖基化,-连接的糖基化发生在特定的氨基酸序列Asn-X-Ser/Thr,其中X是除脯氨酸以外的
任意氨基酸。0-连接的糖基化发生在Ser/Thr氨基酸序列上。蛋白质糖基化与许多疾病的发展密切相
关,在某些疾病状态下,聚糖的相对丰度和分支结构与正常相比发生了变化?,这些异常的变化可为疾
病的早期诊断及治疗提供帮助6
常规的糖蛋白研究方法主要有基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱( MALDI-TOF-MS)、电喷雾
质谱(ESI-MS)、傅里叶变换离子回旋共振质谱(FT-ICR-MS)?等。 MALDI-TOF-MS和ESI-MS这两
种方法都是对糖链和肽段分别研究,以得到糖基化位点和糖链结构信息,或者是在完整糖肽水平上对糖
蛋白结构进行解析。但是在对完整糖肽进行解析时,得到的主要是糖链的结构信息,糖肽序列信息较
少,导致位点鉴定困难,尤其是对于未知的样品。完整糖蛋白的全面解析对于疾病的诊断与治疗、糖蛋
白药物的筛选及蛋白质组学研究具有重要意义。因此,开发完整糖肽水平的研究方法显得尤为重要。
FT-ICR-MS的碰撞诱导解离(CAD)可以得到糖链的结构信息,电子捕获解离(ECD)碎裂方式通过捕获
个自由电子,使其与质子化的多电荷肽段相互作用,从而诱发多肽主链在N-一Ca键处发生断裂,主
要产生C、乙离子,在碎片离子上保留修饰基团为翻译后修饰位点的鉴定提供了重要的信息
MALD-TOF/TOF-MS样品需求量少,且提供丰富的低分子段碎片离子信息。因此,采用多重质谱的联
合分析为完整糖肽的全面硏究提供可能.
本研究以糖蛋白核糖核酸酶B( Rnase B)的完整糖肽为研究对象,采用液相色谱分离富集,联合
MALDI-TOF/TOF-MS和FT-ICR-MS的CAD和ECD解离模式等多种质谱技术,在解析糖链结构的同时,
获得肽段序列和糖基化位点的信息,实现糖蛋白结构的全面、同步解析,为未知及复杂糖蛋白的完整糖
肽的解析提供参考方法。
2014-10-08收稿;201501-30接受
本文系国家自然科学基金面上项目(No.21275134)资助
s*E-mail:lixm@nimac.onshsh132@163.com
第4期
于晶等:糖蛋白糖基化位点及糖型的多重质谱分析
实验部分
2.1仪器与试剂
Acquity超高效液相色谱仪(美国 Waters公司); Ultraflextreme飞行时间质谱仪, Apex-ultra9.4T
FT-ICR-MS质谱仪(德国 Bruker Daltonics公司);DK-SD电热恒温水槽(上海森信实验仪器有限公司);
Sartorius超微量天平(德国赛多利斯公司); Hitachi高速离心机(日本日立公司); Christ冷冻干燥机(德
国 Marin Christ公司)。
核糖核酸酶B、碘乙酰胺(IAA)、三氟乙酸(美国 Sigma公司);胞内蛋白酶Iys-C(美国 Promega公
司);二硫苏糖醇(DT,美国 Amresco公司);肽N糖苷酶F( PNGASE F,美国 New England Biolabs公司)
甲酸(MS级,瑞士 Fluka公司);碳酸氢铵( NEL ACO3,美国 Alfa Aesar公司);2,5-二羟基苯甲酸(DHB)
-腈基4-羟基肉桂酸(HCCA)(德国 Bruker Daltonics公司);乙腈、水(HPLC级,德国 Merck公司)。
2.2实验方法
2.2.1Lys-C酶解 Rnase B称取1 mg Rnase B样品,溶于0.1%甲酸中,配成2mg/mL的样品溶液;
取100μL,加人40puL100mol/ L NHLECO,和50pL20mmol/LDTT,于56℃水浴1h,冷至室温后,加
25uL100mol/LIAA,室温避光反应45min,加0.24pgys-C于37℃反应18h后,加10pL10%甲
酸终止反应。
2.2.2 PNGASE F处理 Rnase B的Iys-C蛋白酶解溶液于100℃变性10min,冷至室温后,加人
PNGASE F酶0.5uL,37℃消化18h
2.2.3色谱条件 Acquity UPLC BEH C1色谱柱(50mm×2.1mm,1.7pm),流动相A为0.02%三氟
乙酸,B为乙腈含0.02%三氟乙酸。梯度洗脱程序:0~35min,2%~37%B;35~-37min,37%~90%
B;37~45min,90%B;45~47min,90%~2%B;47~55min,2%B。流速:0.25mL/min;进样体积:
2.5puL;柱温:35℃;样品盘温度:10℃;检测波长:214nm
2.2.4MALD-TOF/TOF-MS条件肽段或富集后的糖肽取1正点靶,自然干燥后在靶板上点1L
HCCA或DHB。采用正离子反射模式,离子源电压25kV,脉冲离子提取电压22.15kV,离子提取延时
时间110ns,激光频率2000Hz,激光能量95%,每张谱图共采集1500个激光点,校准相对误差<10°。
采用软件 Flexanalysis3.4分析质谱图。
5FT-ICR-MS条件 Nanoesi源正离子模式,Nano喷针流速30WLh,毛细管电压1.8kV,干燥
气温度150℃,干燥气流量3L/min,CAD碰撞能25V,ECD脉冲持续时间0.15s,BCD偏压1.0V
ECD镜头电压13V,ECD加热电流1.7A。
3结果与讨论
3.1 Rnase B糖肽HPLC分离及 MALDL-TOF/TOF-MS分析
本研究选用已