葡萄汁和葡萄酒微生物分析_微生物的监测_分类和计数_国际标准.pdf

1999.4(总、133)
酒
葡萄汁和葡萄酒生物分析(微生物的监测、
分类和计数)国际标准
李华刘延琳华
西北农业人学葡笥酒学院陕西杨装,712100)
●日的
微尘物分析的用的是,监控酒精发酵和(或)苹果酸乳酸发酵的进程,显示可能的微生物病
害,以便在葡萄酒酿造的各个阶段及最后产品中监测出所有的不止常现象
●注意
所有的操作必须利用尤菌材料,以满足在徽生物学工作中的尤菌条件。在进行微生物分析前,必
须正确取样。
●实用范围
微生物分析实用」葡萄酒、萄汁、发嘭醪、螢甜尔以及微生物破败后的上述产品。
微生物分析技术
根据不同的需要,微生物的分析可采用下列技术
1.稳定性试验
1.1氧化试验
1.2培养箱试验
2.微生物检测、鉴定和酵母菌直接计数
2.1浟体或沉淀物的直接镜檢
亚中基誇活体染色
2.3革兰氏染色
2.4嗨分析
2.5酵母菌直接镜檢计数
3.微生物培养计数
3.1固体培养基培养
3.1.1半板培养法(活菌计数)
3.1.2滤膜法(滤膜培养
3.2液体培养基培养一(最大可能数)(NPP)
4.用具
无菌操作室;超狰T作合:培养箱(20C-35C,带温度计);烘箱(十燥箱);干燥火菌箱
(180C,带温度);CO2气瓶;高压蒸汽灭菌钢
数板:载玻片;盖玻片;滤纸;洲油浸物镜用油(香柏油):本生灯:70"%不和959:血球
显微鏡;精度为±.1的pH仪;离心机;水浴锅:漕精灯:电;精度为0.1mg的天
除菌膜过痣设施:微孔滤膜,直径13mm或25m,孔径0.22m;半底漏斗;抽滤瓶;真空泵等
100ml和1000ml容量瓶;5、100、300、500、1000m移液管(或量筒);经消毒的1、10、15
20和25ml吸管:经消赤的离心管;
备注:亦可使用等效的其它设备。
5.取样技术
所収样品应具代表性,可分別用収样阀或长玻璃管在漕罐或木桶屮収样。但在収样前应对坏境进
行消毒以防微生物污染。如用取样阀取样,应作取样前先放出数升。此外,应用70%的酒精或灼烧
木文足根据OV决议OFNO8/95编译的
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对接触表面消声
取样斤应尽快分析;样品在、运时应保持低温(4C-5O。
稳定性试验
日的检测微生物病的可能性:。
原理当将萄漕置」一定的通风和温度条件ド,山」微生物的活动,会引起其感官特性的变化
(如浑浊,产膜,沉淀,帧色改变等)。如有上述变化,则必须用微生物檢验其变化的性质。
操作
1.1氧化试验
取杀菌后的粗滤纸过滤后的50mi酒样,置于用棉寒住的杀菌后的150ml三角瓶中,在室温下放
置最少3天后检查其澄清度,颜色,有否深浊、沉淀、产膜。如有上述现象,则应进行微生物检验。
1.2培养箱试验
収用经消毒粗滤纸过滤后的100ml漕样置」用棉塞塞住的消三角瓶中,在30C的培莽箱中培
养72小时后檎査其感官特性,如感信特性发生变化,则应进行徴生物檢验。
2.微生物检测、鉴定和酵母菌直接计数
2.1液体或沉淀物的镜檢
日的直接镜检是为了观测、区分可能存在的酵母菌和细菌。但是,直接鏡检并不能区分死、活
微生物。
备注使用活体染色法,可检测活酵丹菌数。
原理利用鼎微镜的放大原理,可观测到大小只有以微米计的微生物
操作可以直接用液体或沉淀物在显徽鏡下观测。但液体直接镜檢只有当其微牛物群体数量足够
人(>5×10)个细胞/ml)才有效。
如果葡萄酒中的微生物群体量较低,则应通过离心浓缩斤再镜檢:取10ml摇匀的酒样,用3000
5000转/分离心5?15分钟,去除上清液,将沉淀与剩余的酒样摇匀后镜檢
镜检:用经消毒的吸管取一滴液体或揺匀斤的沉淀物置于ー千净的裁片上,盖上盖玻片,用显
微镜观察。计数时应选取5个不同的视野计数,然后用待立方厘米含有的细胞数表示。如果细胞数量
太多,则应进行稀释。放大倍数通常为400-1000
2.2甲基活体染色
日的区分活酵母和死细胞。
原理细胞中的酶可使染料还原。例如,生活细胞可将甲基統述原成隐色化合物而为色,死
胞则吸附色素而变为色。
试剂0.1%甲基蓝溶液。制备:取0.1g甲基蓝在三角中用100ml蒸馏水溶解后即可。甲基蓝
渀液必须为新配制的
作取一滴样品和一滴中基蓝溶液置」载玻片上,用接种坏(针)混匀,5分钟后作显微镜
直接观察。
果活胞尤色,死细胞为嗑色。
各注该染色法并不可靠,只能用于粗略计数,不推荐将它用于细菌。为了区分微生物(特别是
酵母菌和细菌)最好使用如荧光显微技术等更为可靠的方法。
2.3革兰氏染色法
月的革兰氏染色的月的是为了区分乳酸菌(革学氏阳性)和醋酸菌(革兰氏阴性),并观测它
们的形。
备注兰氏染色并不是绝对的,内为除了乳酸菌和醋酸菌外,还可能存在其它的细菌
原理革兰氏染色法是建立在i由于革兰氏阴性和阳性纠菌间胞壁结构及化学成分的不同所引起
的差异上的。革氏阴性菌的细胞壁富含类脂质,而肽聚糖含量很少,酒精可穿过细胞壁,溶解结品
紫碘液,使细胞保持元色。相反,革学氏阳性菌细胞的细胞肇含有大量的肽聚糖,脂肪含量则很少
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