甲基红共振瑞利散射法测定多肽药物奥曲肽.pdf

第27卷第5期
应用化学
Vol 27 No 5
2010年5月
CHINESE JOURNAL OF APPLIED CHEMISTRY
May 2010
甲基红共振瑞利散射法测定多肽药物奥曲肽
范莉李丹孙阳胡倩倩
(西南大学化学化工学院重庆40075
摘要采用共振瑞利散射(RS)法测定奥曲肽,建立了测定痕量奧曲肽的方法。在pH=3.78的B-R缓冲
溶液中,奥曲肽与甲基红相互作用后,共振瑞利散射显著增强,在280~370mm范围内呈现高的散射强度,且
以310nm处的△s最强。在优化的測试条件下,奥曲肽浓度在0-0.54mgL范围内与散射强度有良好的线
性关系,对奥曲肽的检出限(3o)达3.61g/L。该方法用于合成样品中奥曲肽的测定,回收率为98.3%
100.7%;用于曲肽注射液中奥曲肽含量的测定,结果与HPLC法测得的结果相近
关键词共振瑞利散射,奧曲肽,甲基红
中图分类号:0657.6
文献标识码:A
文章编号:1000-0518(2010)05-058505
DOI:10.3724/SP.J.1095.2010.90413
多肽类药物是当今新药研究最活跃的领域之
1,2
多肽药物的优势在于,用量很少,功能强大,很
少引起免疫反成,几乎没有毒性。多肽药物还克服了蛋白质药物分子量大、制备困难等缺点。奥曲肽
( Octreotide,OCT)是人工合成的环八肽,化学名称为:D-苯丙氨酰-L-半胱氨酰--苯丙氨酰-D-色氨酰L
赖氨酰L-苏氨酰--半胱氨酰--苏氨醇(2→7)环二硫化物,结构如 Scheme1所示。它是天然生长抑素
的长效类似物(半衰期长达2h),其抑制激素分泌的作用比生长抑素强大持久。目前,奥曲肽主要用于
治疗肢端肥大症、消化道肿瘤、上消化道出血和急慢性胰腺炎?等。
HN
NH
H
H
HO CH,
HO
Scheme 1 Chemical structure of octreotide
目前,奥曲肽测定方法有放射性免疫测定法?、高效液相色谱-质谱联用法、高效液相色谱
(HPLC)法?。共振瑞利散射( Resonance Rayleigh scattering,RS)分析法具有灵敏度高、简便快速的特
点,已被广泛用于核酸)、蛋白质川、无机离子、糖类?、药物等的分析。本研究组曾采用RS
技术分析多肽物质5),但RS在多肽药物的分析应用上未见报道。本文研究发现,在酸性条件下,甲
基红可与奥曲肽结合并产生增强的共振瑞利散射信号,最大散射峰位于310nm,且增强程度与奥曲肽
浓度在一定范围内呈线性关系,据此建立了奥曲肽的RRS测定方法。与HPLC法相比,本法具有检测灵
敏度高、选择性好、试剂消耗少、简便快速的特点,可用于痕量奥曲肽的测定。
1实验部分
1.1仪器和试剂
Hitachi F-2500型荧光分光光度计(日本 Tokyo公司),测定狭缝5nm;pHS-3C型酸度计。奥曲肽
2009-06-19收稿,2009-09-14修
西南大学发展基金(SWUF2006001)资助项目
通讯联系人:范莉,女,硕士,副教授;FE-mail.hxanll@swu.edu.cn;研究方向:药物分析
应用化学
第27卷
(OCT,实验室自制)标准溶液:配制成900mg/L的贮备液,冰箱中4℃保存,用时室温下稀释至
0.9mg/L。甲基红溶液( Methvl red,MR,上海三爱思试剂有限公司):配制成32mg/L的贮备液,避光保
存,实验时稀释至0.032mg/L。B-R( Britton- Robinson)缓冲溶液:用0.04mol/LH13PO4、HBO3和HAc与
0.2mol/ L NAOH溶液按一定比例混合配制成不同pH值的缓冲浴液,用精密酸度计进行pH校正。样品
溶液配制:量取奥曲肽注射液(善宁 Sandostatin,瑞士诺华制药有限公司生产,规格为1mL:0.1mg适量
(约相当于奥曲肽20g),置:10mL量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀备用。实验用试剂均为分析纯,实
验用水为二次蒸馏水。
1.2实验方法
在10mL具塞比色管中,依次加人1.5mLpH=3.78的B-R缓冲溶液,适量的奥曲肽标准工作溶液
和2.0mL甲基红工作溶液,用二次蒸馏水稀释至刻度,用力摇匀。放置15min后在荧光分光光度计上
以A。m=A。方式对溶液进行同步扫描、得到共振瑞利散射光谱。于最大共振散射峰A。=310nm处分
别测定体系和试剂空白的散射强度1和,计算△=xms-。
2结果与讨论
2.1共振瑞利散射光谱
采用1.2节实验方法分別对MR试剂空白、OCT和MR-OCT溶液用△A=0进行同步扫描,得到
RRS光谱如图1所示。由图1可知,OCT和MR本身的RRS非常微弱,散射范围大致相同,但峰形存在
差别:在280~370nm范用内,MR的散射强度基本恒定,而OCT在280nm处散射最强,这与OCT的紫
外吸收光谱一致(在280mm波长处有吸收值较小
的紫外特征吸收峰,图[插图所示)。OCT和MR共
存后,RRS峰不仅整体显现了OCT和MR各自的特
点,而且大幅度增强、最大散射峰整体右移。其变化
情况是:OCT浓度在0.09~0.18mg/L时,峰型偏向
300400500
于MR,接近平台峰;OCT浓度达到0.36mg/L.时
平台峰区间新增散射峰,但仍然存在一小段平台峰;10
OCT浓度达到0.45mg/L时,平台峰消失,出现4个
主要散射峰;OCT浓度超过0.54mgL,散射峰进
步增强,但强度非常接近,表明OCT和MR结合趋
A/nm
于饱和。此外,随奥曲肽浓度的增加,在450和
图1奥曲肽-甲基红体系的RRS光普
490mm还出现2个虽较弱但很明显的散射峰;当
RRS spectra of OCT-MR syste
ん=310nm时,△las最大。结果表明,OCT和MR共
MR: 6.4 10. mg/L; buffer solution: 1.5 ml, PH=3.78
a MR: b OCT: c-h OCT-MR
存散射强度的增加是由这2种物质引起,二者之间
(OCT:0.09,0.19,0.27,0.36,0.45,0.54mg/L)
存在相互作用,产生的结合质点导致RRS加强。
inset: Uy spectrum of OCT
2.2反应条件的优化
2.2.1加样顺序的影响一般而言,共振瑞利散射和测定体系中各物质的存在状态相关。对许多测
定体系,加样顺序影响物质存在状态,进而影响测定结果。实验发现,加样顺序直接影响反应体系的散
射强度,最大的加样顺序为:缓冲渀液,甲基红溶液,奥曲肽溶液。
2.2.2溶液酸度的影响在酸性范围内,当pH值在3.29~4.78时,体系的△lRs最大且较恒定(见
图2);当缓神溶液用量为1.5mL时体系的△Im最大。故本文取pH=3.78的B-R缓冲溶液1.5mL
2.2.3甲基红加入量的影响目前的研究结果表明,共振瑞利散射的发生,是由于体系中形成了可导
致共振瑞利散射的分子质点。由图3可知,随着体系中MR的加入,散射逐渐增强,可能是OCT和MR
形成的分子质点逐渐增加;当MR加入量为1.0~2.4mL时,体系△IR逐渐增大但相对平稳,显示出
OCT和MR形成