GBT 14929.5-1994 谷物及其制品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定方法.pdf

中华人民共和国国家标准
谷物及其制品中脱氧雪腐镰刀菌
GB/T14929.5-94
烯醇的測定方法
Method for determination of deoxynivalenol
in cereal and cereal products
1主题内容与适用范
本标准规定了谷物及其制品(蛋糕、饼于、面包等)中脱氧雪腐蠊刀菌烯醇的薄层色谱测定法及免疫
测定法( ELISA)的基本要求。
本标准适用于谷物(小米、玉米、大麦等)及其制品(蛋糕、饼干、面包等)中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测
第一法的最低检出浓度为0.1mg/kg。
第二法的最低检出浓度为0.1ng/kg
第一篇薄层色谱测定法
2原理
谷物及其制品中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇经提取、净化、浓缩和硅胶G蒋层展开后,加热薄层板。由
于在制备薄层板时加入了三策化铝,使脱氧雪腐镰刀菌烯醇在365nm紫外光灯下显蓝色荧光,与标准
比较
3试剂
以下试剂除特殊规定外均为分析纯试剂,水为蒸馏水或同等纯度的水。
1三氯甲烷
3.2无水乙醇
3.3甲醇
3.4石油醚(60~90℃或30~60C)
3.5乙酸乙酯。
3.6乙猜
3.7丙酮
3.8异丙醇
9乙醚
3.10无水乙醚。
3.11紙化铝(AICl16H2O):化学纯。
3.12中性氧化铝:层析用,经300C活化4h,置干燥器中备用
13活性炭:20g活性炭,用3mol/L盐酸溶液浸泡过夜、抽滤后,用热蒸馏水洗至无氯离子,在
中华人民共和国卫生部1994-01-24批准
1994-08-01实施
CB/T14929.5-94
120C烘干备用。
3.14硅胶G:薄层层折用。
3.15脱氧雪腐慊刀菌烯醇(以下简称DON)标准溶液,精密称取5,0 mg DON,加乙酸乙酯-甲醇(19
1)溶解。转入10mL容量瓶中,用乙酸乙酯-甲醇(19:1)稀释至刻度,此标准溶液含DON0.5mg/
mn。吸取此标准溶液0.5mL,用乙酸乙酯-甲醇(19:1)稀释至10mL,此溶液每毫升含DON25g。
4仪器
4.1小型粉碎机
4.2电动振荡器。
4.375mL玻璃蒸发皿。
4.4层析柱:内径2cm,长10cm,不具活塞
4.510mL具塞浓缩瓶:底部具0.2n.刻度尾管。
4.6玻璃板:5X20cm
4.7薄层涂布器:0.3mm。
4.8腰开槽;内长25cm,宽6cm,高4cm
4.9紫外光灯:365nm
4.10微量注射器:10xL、50pL。
4.1150mL平底管。
4.12双波长薄层扫描仪:带数据处理机。
分析步骤
5.1提取
称取20g粉碎样品置于200mL具塞锥瓶中,加8mL水和100mL三氯甲烷-元水乙醇(8:2),密
塞。在瓶塞上涂层水,盖严防漏,振荡1h,通过折叠快速定性滤纸过滤,取25mL.滤液于75mL.玻璃蒸
发皿中,置90℃水浴上通风挥干。
5.2净化
5.2.1液-液分配
5.2.1.1谷物:用50mL石油分次溶解蒸发皿中的残渣,洗入100mL分液漏斗中,再用20mL(玉
米样品用30mL)甲醇-水(4:1)分次洗涤蒸发皿,转入同一分液漏斗中
5.2.1.2谷物制品(蛋糕、饼干、面包等):用100mL石油醚分次溶解蒸发皿中的残渣,洗入250mL分
液漏斗中,再用30mL甲醇-水(4:1)分次洗涤蒸发皿,转入同一分液漏斗中。
振摇分液漏斗1.5min,静置约15min,使分层后,将下层甲醇-水提取液过柱净化,不要将两相交
界处的白色絮状物放入柱内。
5.2.2柱净化
5.2.2.1小麦及其制品:在层析柱下端与小管连结处塞约0.1g脱脂棉,尽量塞紧,先装入0.5g中性
氧化铝,平表面,再加入0.4g活性炭,敲紧。将层析柱下端小管插入一橡皮塞,塞在抽瓶上,拙漾瓶
中放一平底管接受过柱液,将抽滤瓶接上水泵或真空泵,稍稍开启泵,使活性炭压紧,将分液漏斗中的甲
醇水提取液小心地沿管壁加入柱内,控制流速为每15s18~20滴(3mL/min),甲醇“水提取液过柱快完
毕时,加入10mL甲醇-水(4:1)淋洗柱,抽滤,直至柱内不再有液体流出。过柱速度控制在2~3mL
min,速度太快净化效果不好,太慢耗时太长。
5.2.2.2玉米:同5.2.2.1,只是将活性炭的用量改为0.3g。
5.3制备薄层层析用样液
将过柱后的洗脱液倒入75mL玻璃蒸发皿中,用少量甲醇-水(4:1)洗涤平底管。将蒸发皿置沸水
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GB/T14929.5-94
浴上浓缩至千。
5.3.1小麦:趁热加入3mI.乙酸乙酯,加热至沸,在水浴锅上轻轻地反复转动蒸发皿数次,使充分沸
騰将残渣中的I))N溶出,并将乙酸乙酯挥发至干,再加入3mL乙酸乙酯同样处理一次,将溶剂挥千,
最后加3mL.乙酸こ酯,加热至沸,放冷至室温后转入浓缩瓶中,再用三份1,5mL乙酸乙酯洗涤蒸发
Ⅱ,并入浓缩瓶中。
5.3.2小麦制品、玉米:趁热加入3mL.乙酸乙酯,加热至沸,在水浴锅上轻轻地反复转动蒸发量数次,
使充分沸腾,将殒渣中DON溶出,放冷至室温后转入浓縮瓶中。加约0.5mL甲醇-丙酮(1:2)于蒸发
皿中,用玻棒搅动溶解残渣,将蒸发皿置水浴锅上挥干溶剂后,加入3mL乙酸乙酯,加热至沸,转动蒸
发皿,使充分湘腾,放冷至室温后转入同一浓缩瓶中,再用0.5mL甲醇-丙翻(1:2)和3mL乙酸乙酯
同样处理一次,乙酸乙酯提取液并入浓缩瓶中。
将浓缩瓶置约95℃水浴锅上,用蒸汽加热吹氮气浓缩至干,放冷至室温后加入0.2mL三氯甲烷
乙腈(4:1)溶解残渣留作薄层层析用。
5.4测定
5.4.1薄层板的制备:4g硅胶G加约9mL-15%氯化铝(AICl36H2O)水溶液,研磨约2min至呈粘
稠状,铺成5cm×20cm的薄层板三块,置室温干燥后,于105℃活化1h,贮干燥器中备用。
5.4.2点样:在每块薄层板上距下端2.5cm的基线上点样。
第一块板:对毎一个样品先点第一块薄层板。在距板左边缘1.8cm处点25L样液,在距板上端
5cm处的横线上并与基线样品点相对应的位置上点2LDON标准液(50ng)。按5.4.3.1条下横展
薄层板,挥干溶剂后再在薄层板上距左边缘1cm处的基线上点2LDON标准液(50ng)。
第二块板:在第一块板上未显荧光的样品则需在第二块薄层板上距左边缘0.8~1cm处滴加25l
样液,加1lL标准液(25ng),在距左边缘2cm处滴加1pL标准液(25ng),在距右边缘1.2cm处滴加
2al.标准液。对阳性样品可进行概略定量:在薄层板上距左边缘0.8~1cm处滴加样液点(根据情况估
计滴加点,或稀释后定量),在距板左边缘2cm处和在距右边缘1.2cm处分别滴加二个标准点,DON
的量可为50ng、75ng、100ag。再在距板上端1.5cm处的横线上点三个DON标准点(各约50ng),使
之与基线上的三个点相对应。
5.4.3展开
横展剂:乙迷、乙迷-丙酮(95:5)或无水乙醚。任选其中一种,使样品DON点偏离原点0.7~1cm,
刚好与杂质荧光分开。
纵展剂:三氯甲烷-丙酮异丙醇(8:1:1)
三氯甲烷丙-异丙醇-水(7.5t1:1.5t0.1)