GB7918.4-1987化妆品微生物标准检验方法 绿脓杆菌.pdf

中华人民共和国国家标准
UDC668.58:576
化妆品微生物标准检验方法
85.07
绿肱杆菌
GB7918,4-87
Standard methods of microbiological
examination for cosmetics
seudomonas ae
cruginos
绿脓杄菌在自然界分布甚广,空气、水、土壤中均有存在。对人有致病力,常引起人皮肤化脓感染
特别是烧伤、烫伤、眼部疾病忠者被感染后,常使病情恶化,并可引起败血症,因此,在化妆品卫生标准中
烻定不得检出绿脓杄菌
方法提要
根据本菌生物学特征:革兰氏阴性杆茵,氧化醇阳性,能产生绿脓薗素。此外还能液化明胶,还原硝
酸盐为亚硝酸盐,在42℃条件下生长等,可与类似菌相区别
2培养基和试剂
2.1 SCDLP液体培养基
见GB7918.1-87《化妆品微生物标准检验方法总则》。
2.2十六烷三甲基溴化铵培养基
成分:牛肉膏
蛋白胨
氯化钠
十六烷三甲基溴化铵
0.3
琼脂
20g
蒸傜水
制法:除琼脂外,将上述成分混合加热溶解,调pH为7.4~7.6,加入琼脂,115C(101b)26min灭菌
后,制成平板备用。
2.る乙酰胺培养基
成分:乙酰胺
氯化钠
5.0g
无水磷酸氢二钾
1.39g
无水磷酸二氢钾
0.73g
硫酸镤(MgSO.·7H2
0.5
酚红
0.012
琼脂
蒸馏水
制法:除琼贈和酚红外,将其他成分加到蒸馏水中,加热溶解,调pH为7.2,加入琼脂、酚红,121C
中华人民共和国卫生部1987-05-28批准
1987-10-01实施
GB7918,4-87
(151b)20min高压灭菌后,制成平板备用。
2.4绿胺菌色素测定用培养基
成分:蛋白陈
20g
氯化镁
酸钾
琼脂
18g
甘油(化学纯)
蒸馏水
1000ml
制法:将蛋白胨、氯化镁和硫酸钾加到蒸馏水中,加温使溶解,调pH至7.4,加入琼脂和甘油,加热
溶解,分装于试管内,115℃(101b)20min高压灭菌后,制成斜面备用。
2.5明胶培养
成分:牛肉膏
蛋白胨
明胶
120g
蒸馏水
1000ml
制法:取各成分加在蒸馏水中浸泡20min,随时搅拌加温使溶解,调pH至7.4,分装于试管内,经
115℃(101b)20min灭歯后,直立削成高层备用。
2.6硝酸盐蛋白胨水培养基
成分:蛋白胨
母浸膏
硝酸钾
亚硝酸钠
蒸水
1000ml
制法:将蛋白陈和酵母浸膏加到蒸馏水中,加温使溶解,调pH为7.2,煮沸过滤后补足液量,加入硝
酸钾和亚硝酸钠,溶解混匀,分装到加有小倒管的试管中,115℃(101b)20min灭薗后备用。
2.7普通琼脂斜面培养基
成分;蛋白胨
牛肉膏
氯化钠
琼脂
蒸馏水
1000mi
制法:除琼脂外,将其余成分溶解于蒸馏水中,调pH为7.2~7.4,加入琼脂,加热溶解,分装试管
121℃(151b)15min高压灭菌后,制成斜面备用
仪器
3.1培养箱:37℃、42C。
3.2锥形烧瓶
3.る试管。
3.4灭菌平皿。
3.5灭菌刻度吸管。
6显微镜
3.7载玻片。
3.8接种针、接种环。
GB7918.4-87
3.9电炉。
3.10高压消毒锅。
4操作步骤
4.1增菌培养:取1:10样品稀释液10ml加到90 ml SCDLP液体培养基中,置37℃培养18~24h
如有绿脓杆菌生长,培养液表面多有一层濛菌膜,培养液常呈黄绿色或蓝绿色。
注:如无 SCDLP液体培养基时,可用谱通肉汤培养基。检验合防腐剂的化妆品时,花每1000mI普通肉汤中加1g卵
磷脂、7g吐温80。
2分离培养:从培养液的蒋菌膜处挑取培养物,翊线接种在十六烷三甲基溴化铵琼脂平板上,置
37℃培养18~24h。凡绿脓杄菌在此培养基上,其菌落扁平无定型,向周边扩散或略有蔓延,表面湿润,
菌落呈灰白色,菌落周围培养基常扩散有水溶性色素,此培养基选择性强,大肠艾希氏菌不能生长,革兰
氏阳性菌生长较差。
在缺乏十六烷三甲基溴化铵琼脂时也可用乙阮胺培养基进行分离,将菌液划线接种于平皿中,放
37℃培养24h,绿脓杆麒在此培养基上生长良好,落扁平,边缘不整,落周围培养基略带粉红色,其
他菌不生长。
4.3染色镜检:挑取可疑的菌落,涂片,革兰氏染色,镜检为革兰氏阴性者应进行氧化酶试验。
4.4氧化酶试验:取一小块洁净的白色滤纸片放在灭菌平皿内,用无萬玻璃棒挑取绿脓杆菌可疑菌
落涂在滤纸片上,然后在其上滴加一滴新配制的1%二甲基对苯二胺试液,在15~30s之内,出现粉红
色或紫红色时,为氧化晦试验阳性,若培养物不变色,氧化酶试验阴性
4.5绿脓薗彖试验:取可疑菌落2~3个,分别接种在绿脓菌尞测定用培养基上,置37℃培养24h,加
入氯仿3~5ml,充分振荡使培养物中的绿脓素溶解于氯仿液内,待氯仿提取液呈蓝色时,用吸管将氯
仿移到另一试管中并加入1N的盐酸1ml左右,振荡后,静置片刻。如上层盐酸液内出现粉红色到紫红
色时为阳性,表示被检物中有绿脓菌素存在
4.6硝酸盐还原产气试验:挑取被检的纯培养物,接种在硝酸盐陈水培养基中,置37℃培养24h,观
察结果。凡在硝酸盐陈水培养基内的小倒管中有气体者,即为阳性,表明该菌能还原硝酸盐,并将亚硝
酸盐分解产生氮气。
4.7明胶液化试验,取绿脓杄薗可疑菌落的纯培养物,穿刺接种在明胶培养基内,置37℃培养24h,
取出放冰箱10~30mlin,如仍呈溶解状时即为明胶液化试验阳性,如凝間不溶者为阴性
4.842℃生长试验:挑取纯培养物,接种在普通琼脂斜面培养基上,放在41~42℃培养箱中,培养
24~48h,绿脓杆菌能生长,为阳性,而近似的荧光假单胞菌则不能生长。
5检验结果报告
被检样品经增茵分离培养后,经证实为革兰氏阴性杆菌,氧化酶及绿脓薗素试验皆为阳性者,即可
报告被检样品中检出有绿脓杆菌。如绿脓菌素试验阴性而液化明胶、硝酸盐还原产气和42C生长试验
三者皆为阳性时,仍可报告被检样品中有绿脓杆菌
附加说明
本标准由中国预防医学科学院环境卫生监测所归口。
本标准由“化妆品微生物标准检验方法”起草小组起草
本标准主要起草人周淑玉
本标准由中国预防医学科学院环境卫生监测所负责解释。