化学发光免疫分析法检测血清中前列腺特异抗原复合物.pdf

第44卷
分析化学( FENXI HUAXUE)研究报告
第8期
2016年8月
Chinese Journal of Analytical Chemistry
1209~1214
Do:10.190
化学发光免疫分析法检测血清中前列腺特异抗原复物
周友俊』李娇霞程绘理』杨乔が何美家』郭丽邓令夏
(昆明医科大学附属延安医院核医学科,第三附属医院核医学科,昆明6001)
摘要采用杂交瘤技术枃建抗前列腺特异抗原-al抗胰凝乳蛋白酶( Prostate spplifip anti- al-xntichymot
rypsin complex, PSA-ACT单克隆抗体(单抗)细胞株,共获得8株稳定分泌ドSA-AT争抗的争株,纯化后进
行免疫特性鉴定并做单抗配对。选择其中ー对单抗,采用辣根过氧化物睡(HRp)心鲁米umo9
化学发光体系,建立了测定人血清中PSA-ACT浓度的化学发光酶免疫分析方法(CLEA)。对包被缓冲液、包
被抗体浓度,酶标抗体稀释度、温育时间、发光反应时间和免疫反应步彤等实唆参数丁优化。在最佳实验
条件下,PSA-ACT浓度在5~40ng/mL范围内线性关系良好
甲为。吧m.批内相对
标准偏差(RSD)为46%-6.6%,批间RSD为5.7%-8.0%、,国收举为,4104.2%,与游离前列腺特
异性抗原F-FSA的交叉反应率为0.6%。本方法简单、稳定、卖敏、快速、为环變PSA-ACT的 CLSIA试剂
盒奠定了基础。
关键词前列腺特异抗原;前列腺癌;化学发光所免か断:)球根过氧化酶
前列腺癌( Prostate
PCa)是勇性最常免的駛瘤之一,近年来其发病率呈明显的上升趋
势”“。早期诊断和治对控制Ra尤为野へ暖并抗原( Prostate specific antigen, PSA)是目前
临床广泛采用的PCa检测标志物-?。
Fト代衣精液以高态(FePF)存在,血液中通常为
结合态( Complexed-psa,C-FSA),正常男性液中句检测到的FSA(TSA)一般低于4g/mLl。当
T-PSA>10ng/mL时,患者患前列腺
率极高,恒TPSA含量为4~10g/mL时,PSA检测的特异性
仅为59.2%,假阴性率即漏诊率可公
[11]
因为PSA不具有肿瘤特异性,除PCa外,良性前
列腺增生、炎性病变和梗死等前列腺变,爹年龄的增长,都能引起T-PSA含量的升高,因此,T-PSA
含量4~10ng/mL成为了临凑诊断灰区。
研究者提出了不同的K械数,宇正RA检测值,提高FSA检测的准确率。目前临床上应
用最多的是采用测定FSA水平并计算F-FSA/T-PSA(F/T)比值的方法进行进一步筛査。但是,
F-FSA在血清中不稳定月T比在诊断前列腺将时缺乏统一标准,亦难以根据这一范国内的Fん
筛查和诊断PCa']
血清中CF要以前列腺特异抗原以-抗胰凝乳蛋白醇(FSA- al-antichymotrypsin complex,rSA
ACT)的形式存在、研究表明,以血清中 PSA-ACIT含量作为检测指标,可提高对PCa早期诊断的特异性
和准确性"で。与间时检测TFSA和F-SA相比,ACT检测具有稳定、简单、成本低、不受年龄因
素影响等优势感性和特异性均优于T-SA检测,且可以降低PCa的筛查成本-2。
的检方法与FFA及TFSA类似,酶联免疫分析法( ELISA)是最常用的方法2,但
目前没检测 SAACT的商业化试剂盒
与法相比,化学发光酶免疫分析法( CLEIA)具有灵敏度高、线性范围宽、操作简单且易于实
现高通量检测筹特点。本研究制备了抗PSA-ACT单克隆抗体(单抗),采用辣根过氧化物酶
HR?传化鲁米诺( lumino)-H202化学发光体系,建立了双抗体夹心化学发光酶免疫分析方法,用于
PSA-ACT/的高灵敏度检测,为开发可用于临床检验的PSA-ACT试剂盒奠定了实验基础
2015-11-25收稿;201606-07接受
本文为云南省应用基础研究(昆医联合专项)项目(No.2014FB077)资助
*E-mail:13888158986@163.com
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分析化学
第44卷
2实验部分
2.1仪器与试剂
BHP9540微孔板发光分析仪(北京滨松光子技术有限公司);MX-F型固定式混
全
疗器械有限公司);WZ-2A型微量振荡器(北京海淀电子医疗仪器厂)
sp2/0骨髓瘤细胞(国家生物医学分析中心病毒安全检測实验室提供);6-8同龄的雄性にル/c小
鼠(军事科学院实验动物中心):RPM1640培养基、牛血清蛋白(BSA)(美国G和co公司;PSA-ACr
Antigen(加拿大 Biospacific公司); PSA Antigen F- PSA Ag protein(英国 Biorby公司入弗庆先全佐剂、弗
氏不完全佐剂和HAT/HT培养基(美国Sgma公司);单克隆抗体分型试浏拿 Sotthem._iotech公司);
rprotein A蛋白纯化试剂盒(美国CE公司);BCA蛋白浓度试剂盒(江苏云天生钞术研究所);辣根
过氧化物酶(HRP,美国 MP Biomedicals公司);鲁米诺化学发光底物液(苏州贝际沙生物医药科技有限
公司);其它试剂均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)。
2.2动物免疫和细胞融合
采用免疫原PSA-ACT对6-8周龄的雌性 Balb/c述行語皮下免章,初次免疫剂量为20y只
15日后进行初次加强免疫(10Wg只),此后每隔28天母行一次却握色ん第4次加强免疫10天后断
尾取血,以1g/ ml PSA为包被原,采用间接E法ツ校測咆浄电PSA抗体的效价。取抗血清效
价大于1:800的小鼠的牌细胞与小鼠骨髓瘤进行织胞融合,彩用HAT培养基对杂交瘤细胞进行
培养,去除未融合的脾细胞和骨髓瘤细胞。
2.3杂交瘤细胞株的筛选及培养
2.3.1抗体亚类鉴定按 Southern Biokk単で放体分型试剂盒说明书,以浓度为1いg(mLSA抗
原包被酶标板,依次加入细胞培养上清(1の>」)和00稀释的HRP标记二抗进行反应。根据
0D40值最高的孔所对应的酶标二抗确定该孔抗体的类
2.2抗体特昇性廃选分别以TFSA、)し)くCT为抗原进行包被,采用间接ISA法对杂
交瘤细胞进行筛选,随后对阳性细胞株进不克隆。多次筛选、克隆后,获得可分泌单一抗PSA-ACT抗体
的细胞株。
2.4单克隆抗体的制备
对可分泌单一抗PSA-ACT抗体的処胞様进行扩大培养,用体内诱生法制备腹水。选取10周龄的
雄性小服接种杂交细食で天注片演护補自身変功能。将用性杂交知胞稀释后注人小
腹腔,天后收集小鼠腹水、间接応K法测定腹水效价。利用onA亲和柱法纯化腹水,得到的
纯化抗体用PS透析く次、心号存
2.5单克隆抗体的鉴赵
采用SDS-リ火测定抗的纯度,采用BCA法测定抗体的浓度。以甲胎蛋白( Alpha Fetoprotein
AP)、癌胚抗原( Carcinoembryonic antigen,CEA)、广谱肿瘤标志物( Carbohydrate antigen50,CA50)、卵
巢癌相关抗原( Carbohydrate antigen125,CA125)、乳腺癌相关抗原( Carbohydrate antigen153,CA153)、
F-PSA等为包被原,来用间