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重庆医学2014年5月第43卷第15期
1829
论著
NLK通过Smad4负调控TGFB信号通路
张力民,詹轶群,李国,杨晓明?
军事医学科学院放射与辐射医学研究所,北京100850)
摘要:目的探讨NLK对转化生长因子β(TGFB)信号通路的影响及其分子机制。方法采用蛋白质稳定性实验检测
NLK对Smad4蛋白质降解的影响;体内泛素化实验检測过表达、NLK对Smad4泛素化修怖的影响;荧光素酶报告基因实验检测
NLK对TGFB信号通路报告基因载体CAGA-luc和3TP-luc的影响;实时定量PCR技术检测NLK对TGFB信号通路靶碁因p2
和PAI-1的影响。结果在HEK293T细胞内,过表达NLK促进Smad4的降解和泛素化修怖;在HEK293T细胞内过表达NLK
抑制细胞因子TGFB对CAGA-luc和3TP-luc的激活作用;在HepG2细胞内过表达NLK抑制TGFB信号通路基因p21和
PAI-1的表达。结论NLK促进Smad4的泛素化修饰和降解,进而抑制TGFB信号通路。
关键词:NLK;Smad4蛋白质;转生化长因子β;信号通路
doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2014.15.002
文獻标识码:A
文章编号:1671-8348(2014)15-1829-03
NLK negatively regulate TGFB signaling pathway via Smad4
Li Wei. Y
The Research Institute of Radiation Medicine, the Academy of Military Medicine Science, Beijing 100850, China
Abstract: Objective To study the effect of NLK on TGF3 signaling pathway and explore the molecular mechanism. Methods
Protein stability assay was used to determine the influence of N. K on the degradation of Smad4. In vivo ubiquitination assay was
ied to detect the effect of NLK on the ubiquitination of Smad4. Luciferase reporter gene assay was used to detect the effect of
on CAGA-LUC and 3TP-LUC, the responsive reporter of TGF signaling pathway. Real time PCR was applied to examine the
effect of NLK on the expression of p21 and PAI-1, the target genes of TGF signaling pathway Results In HEK293T cell, over ex
ression of NLK promotes the degradation and ubiquitination of Smad4 In HEK293T cells, Ectopic expression of NLK inhibits the
activity of CAGA luc and TP luc stimulated by TGF. In HEPG2 cells, over expression of NLK inhibits the expression of p21 and
PAI 1, the target genes of TGFP signaling pathway. Conclusion NLK promotes the ubiquitination and degradation of Smad4, conse
quently inhibits TGFB signaling pathway
Key words: NLK: Smad4 protein; TGF; signaling pathway
NLK是一种保守的丝/苏氨酸蛋白激酶,识别靶蛋白中的分化、胚胎发育等过程中发挥不可橉代的作用。TGF信号通
S/TP模序,通过对靶蛋白进行磷酸化修饰的方式调控其活路调控异常可引起纤维化和肿瘤等多种疾病。Smad蛋白家族
性,进而影响靶蛋白参与的生物学过程リ。NLK可磷酸化转是TGFg/Smad信号通路进行信号转导的关键分子。Smad家
录因子cmyb,谜酸化的cmyb在E3泛素连接酶Fbxw7的作族可分为三类:R-Smad(Smad1/5/8,Smad2/3)、Co-Smad
用下被泛素化修饰,进而通过蛋白酶体降解。NLK在多个(Smad4)和I-Smad(Smad6/7)。蛋白激酶可通过影响Smad
物种的胚胎发育过程中发挥至关重要的作用。在爪蟾胚胎发家族蛋白的礫酸化修饰调控TGFB信号通路。CDK2/4介导
育过程中,NLK的缺失导致爪蟾头部发育异常。在海胆胚Smad3第8位苏氨酸、第179位苏氨酸和213位丝氨酸的磷酸
胎发育过程中, Notch信号通路激活NLK的激酶活性,NLK化修饰,抑制Smad3的转录活性,进而抑制TGF3信号通
磷酸化TCF并抑制TCF-B- catenin复合体的活性,促进海胆胚路门。ERK通过磷酸化Smad2第8位苏氨酸増强Smad2的
胎的中胚层诱导过程り。在小鼠中,非经典wnt信号通路通转录活性。关于Smad4的磷酸化修饰报道较少,ERK可磷
过CaMKⅡTAK1级联反应激活N1LK,NLK磷酸化 SETDB1酸化Smad4第277位的苏氨酸,促进Smad4进入细胞核。
并与CHD7结合形成NLK- SETDB1-CHID7转录抑制复合体,NILK可与Smad4相互作用并磷酸化Smad4第9位苏氨酸和
抑制核转录因子PPAR的转录活性,关闭靶基因的表达,从第138位丝氨酸12,但NLK与Smad4相互作用的功能并不清
而促进小鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。NLK与肿楚。本研究中,笔者发现NLK可通过增强Smad4的泛素化修
瘤发生存在密切的联系,在不同肿瘤中发挥不同的功能。在肝饰促进Smad4的降解,进而负调控TGFβ信号通路的活性。
癌细胞中,NLK的表达水平升高,NIK可促进细胞周期关键1材料与方法
调控蛋白- Cyclind1的表达,因此,NlK在肝癌中发挥癌基因1.1材料Flag-NIK、 Flag-nlk(KM)、HA-Ub、 myc-smad4
的功能的。在前列腺癌中,NLK抑制雄激素受体的表达和转CAGA-luc、3TP-luc和pRL-TK载体为实验室前期构建保存。
录活性,促进前列腺癌细胞的凋亡,发挥抑癌基因的作用门。myc抗体(9E10)、Smad4抗体(B8)、 B-actin抗体(C4)、辣根过氧
转化生长因子(TGFB)信号通路在调控细胞生长、增殖、化酶(HRP)标记羊抗鼠抗体(sc2005)和 Proteina/ G PLUS
基金项目:国家重点基础研究发展计划(973计划)基金资助项目(2013CB910800。作者简介:张力民(1984-),技师,博士,主要从事
功能基因组学研究。?通讯作者,Tel:(010)6931428;E- mail: xiyang2Gbmi.ac.cn。