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中国酿造
2018年第37卷第4期
研究报告
总第314期
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glmU基因单功能敲除对大肠杆菌生产氨基葡萄糖的影响
董瑞真,李丕武,石凤,李康,汪俊卿
(齐鲁工业大学生物工程学院山东省微生物工程重点实验室,济南250353
摘要:大肠菌中的glmU是葡糖胺-1-磷酸尿苷酰转移酶/葡糖胺-1-磷酸乙转移酶双功能基因。同源单交换方法敲除大肠杆菌
中葡糖胺-1-磷酸乙酰转移酶单结构域基因glmU,即利用重叠PCR将葡糖胺-1-磷酸尿苷酰转移晦结构域内603bp序列与抗性基因
amr连接,经过末端单酶切( Find l)后电转化至大肠杆菌(E. COLD BL21感受态细胞中,经同源臂单交换,将抗性基因amp整合至
glmU基因内部,实现该结构域功能失活的同时,保留糖-1-酸尿苷酰转移酶功能域活性。通过发酵实验分析gmU单结构域缺
失在大肠杆菌中对氨基简荀糖生产的影响。结果表明,发酵20h后重组菌的氨基简萄糖产量为1049.6mgL,为原始菌E. coli BL21氨
基简萄糖产量10334mgL的10.2倍。表明gnU是影响大肠杆菌产生氨基蔔糖的关键基因,敲除gmU基肉可增加氨基简蔔糖积累
关键词:氨基葡蔔糖;gmU基;大肠杆菌;单功能基因敲除;冋源单交换
中图分类号:TS201
文章编号:0254-5071(201804-0023-05
doi:10.11882/isn.0254-5071.2018.04.005
Effect of single function knockout of glmu gene on glucosamine production by Escherichia coli
DONG Ruizhen, LI Piwu, SHI Feng, LI Kang, WANG Junqing*
(Shandong Provincial Key Laboratory of Microbial Engineering, Schoo/ of Bioengineering, Qilu University of Technology
Abstract: gimu in Escherichia coli is a bifunctional gene with both glucosamine-1-phosphate uridyl transferase and glucosaminc-1-phosphatc acct
transferase activity. The structural domain gene of glucosaminc-1-phosphate acetyl transferase of gimu was knocked out by homologous single cx
change method. The 603 bp fragment of the glucosamine-1-phosphate acetyl transferase was ligated with the resistance gene amp"by overlapping
PCR, and the recombinant gene fragment was electricity transformed into E. coli BL21 competent cells after terminal single digestion(Fin l), and
the resistance gene ampwas inserted into the gmu gene. The functional activity of the structural domain was inactivated, while the activity of u
cosamine-i-phosphate uridyl transferase was preserved. The effect of glmu on the glucosamine production by E. coli was analyzed by fermentation
cxperiments. Results showed that aftcr 20 h of fermentation, the glucosamine yicld of recombinant bacteria was 1 049.6 mg/L, which was 10.2 times
that of original bacteria E coli BL21 (103.34 mg/). The results indicated that gmu was the key gene that affected the glucosamine production by
E coli, the knockout of glmu gene could increase the accumulation of glucosamine
Key words: glucosamine; gene glmu; Escherichia coli; single function knockout; homologous single exchange
氨基葡萄糖( glucosamine, GICN)也称葡萄糖胺,是
已有利用Red同源重组技术敲除大肠杆菌( Escherich
种重要的功能性单糖,可作为食品配料使用,还是结缔组colD的甘露糖转运子编码基因(manX和乙酰氨基葡萄糖
织和胃肠道结膜中糖蛋白的天然成分。在呼吸系统的粘液转运子编码基因(nagb以及葡萄磷酸转运系统编码基
分泌物中GcN也发挥着作用叫。 MCALINDONTE等即认为?(ptsの,减少了发酵液中氨基葡萄糖和乙酰氨基葡萄糖
GlcN能缓解关节炎疼痛。 RICHY F等认为GlcN可治疗膝由胞外向胞内的转运,同时还分别敲除了糖酵解途经相关
骨关节炎。GlcN的生产方法主要有甲売素水解法和酶生物基因丙酮酸溦嗨编码基因pykA和pykF,氨基葡萄糖总产量
转化法以及微生物发酵法?。甲壳素水解法的原料贝壳类有所提高。但是在现有改造条件下,细胞中依然存在着氨
生产的 GICN易对人体产生过敏反应,该方法消耗大量的酸基葡萄糖的消耗途径,本实验敲除glmU基因葡糖胺-1-磷
碱导致环境污染严重?。酶生物转化法所需的甲売素酶的酸乙酰转移酶结构域,减少氨基葡萄糖的消耗途径。
价格高增加了生产成本。微生物发酵法利用微生物代谢
GlmU蛋白是由456个氮基酸组成的双官能团嗨,有尿
合成GlcN,在基因水平上对菌种进行改造具有广阔的发展苷酰转移和乙酰转移晦两种活性明。大肠杆菌(E.colD
空间。微生物发酵法具有原料来源易获得,发酵时间比较 gimu蛋白参与细胞壁肽聚糖和脂多糖的合成明。作为双功
短,对坏境污染小以及服用不会出现过敏反应等优点?。能嗨的glmU在医学界被认为是细菌靶,因为glmU蛋白的抑
收稿日期:2017-12-07
修回日期:2018-03-28
基金项目:山东省自然科学基金(ZR2016CB04
作者简介∷董瑞真(1992-),女,硕士研究生,研究方向为微生物酶技术
通讯作者:汪俊卿(1988),男,讲师,博士,研究方向为发酵工程和微生物酶技术。
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