大肠杆菌代谢物组成的核磁共振分析.pdf

第39卷
分析化学( FENXI HUAXUE)研究报告
8期
2011年8月
Chinese Journal of Analytical Chemistry
1186~-1194
DO1:10.372-4/SP.J.1096.2011.01I86
大肠杄菌代谢物组成的核磁共振分析
叶央芳2张利民』安艳捧豪富华唐惠儒
(波谱与原子分子物理国家重点实验室,武汉磁共振中心,中国科学院武汉物理与数学研究所,武汉430071)
2(宁波大学应用海洋生物技术教育部重点实验室,宁波315211)
摘要为了认识重要模式生物大肠杆菌的内源性代谢物组成,本研究综合使用一维和二维高分辨核磁共
振波谱技术,系统测定了大肠杆菌的代谢物种类和含量。结果表明:核磁共振方法可检测到分来自多个代
谢途径的氨基酸、有机羧酸、糖类、核及其行生物等40多种高丰度代谢物。葡荀糖是稳定期大肠村菌中含
量最富的物质;谷氨酸、甜菜碱、腐胺和核糖5磷酸的含量次之;其它代谢物的含量都相对较低。这些结果
证实NMR技术能同时有效检测细菌中含量丰富且极性各异的初级和次级代谢产物
关键词大肠杆菌;代谢组;核磁共振(NMR〉
引言
大肠杅菌( Escherichia coli)因其遗传背景清楚且易培养而被广泛用作各种生物化学、生物技术研究
的模式微生物。大肠杆菌的基因组、转录组、蛋白质组、相互作用组、代谢组和生理组等方面都得倒了
不同程度的研究。尽管DNA、mRNA以及蛋白质的存在为生物过程的发生提供了物质基础,但代谢户
物和代谢表型是基因型与环境共同作用的综合结果。因此,代谢组学研究可以揭示生物体的最终生命
活动状态及对内源和/或外源刺激的综合应答的本质,也是对基因组学和蛋1质组学研究信息的扩展和
重要补充
尽管目前还没有一种单一的实验方法可获得E.coli中全部的代谢物组成信息,但E.coli代谢纯
的研究已取得了迅猛发展,已经从早期的酶学方法?和薄层层析(TLC)方法演变成以质谐(MS)为
主的高通量分析技术9。气相色谱质谱法(GCMS)可检测到E.coli的200多种代谢物"の;液相色谱
质谱(L.C-MS)技术被用于检测不同代谢表型E.coli的果糖-,6二磷酸、肌苷酸、环磷酸酰、苯内氨酸
和组氨酸等特定代谢物的变化,或被用于分析E.coli在碳或氮饥俄状态下68种代谢物的响应特
征。此外,毛细管电泳电喷雾质谱联用技术(CE-EIMS)也被应用于分析E.coli的代谢产物.但
这3种基于MS的代谢组研究方法均面临定量分析与代谢物结构的可靠确定等问题
基于核磁共振(NMR)的微生物代谢组学技术在微生物分类*?、突变体筛选?和污染物降解方
面得到了成功应用,并证实了基于NMR的代谢组学技术是一种可靠的、高通量的研究方法。该方法通
常不需要分离过程就可以对代谢物进行结构确定和定量分析,同时貝有良好的重现性。基于NMR
代谢组数据常常与质谱数据具有较强的互补性,但日前基于NMR的微生物代谢组学技术对模式牛物
大肠杆菌的研究相对较少。主要间题包括微生物代谢组的相关核磁共振波谱学基础数据相对不足,大
肠杆菌代谢物的结构确定的基础工作也相对缺乏。为了获得这些重要的基础数据,本研究对标准大肠
杆菌菌株HB101的代谢物进行了系统的结构确定以及半定量分析。
2实验部分
2.1菌株、仪器与试剂
标准大肠杄菌菌株 HBO AB93057购自中国典型培养物保藏中心。所爿的 Brukcr AVII1600MH
谱仪(德国 Bruker公司),配有超低温探头。乙腈、NaCI、NaH2PO2·2H2O和K2HPO4?3H2O(分析纯,上
2010-1020收稿:20l1-01-21接受
本文系国家杰出青年科学基金(N0.20825520)、传染病专项基金(N。.2009ZX10601)、浙汇省自然科学基金(No.Y30900460)以及予j波大学
学科项I(No.xk109120)资的项f
s E-mail: huirutang(@ wipm ac, cn
第8期
叶央芳等:大肠杆菌代谢物组成的核磁共振分析
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海国药集团化学试剂有限公司);蛋白胨与酵母膏(武汉市杰辉生物技术有限公司);磷酸盐缓冲液
(PBS,pH7.2~7.6,博土德生物工程有限公司);NaN(西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司);重水
(99.9%氘代)和2,2,3,3氘代三甲基住烷丙酸钠(TSP)购自美国 Cambridge Isotope Laboratories公司。
2.2实验方法
2.2.缓冲液和提取液的配制钠钾磷酸缓冲液(O.1 mol/L NAH2POK2HPO4,pH7.4,含10%D2O,
0.1%NaN3,0.005%TSP)用二次蒸馏水配制";代谢物提取液由钠钾磷酸盐缀冲液与乙腈按体积比
l:1配制获得。
2.2.2样品的制备和提取挑取大肠杆菌单菌落转接于新鲜配制的 Luria- Bertani(LB)培养液中,在
37C活化培养24h后,作为接种源分别转接到6个含有30mLLB培养基的三角瓶中,一瓶培养液即一
个平行样。在37℃恒温振荡(150 r/min)培养24h直到稳定期。快速取样,把三角瓶置于冰上以猝灭代
谢过程,在4C下以6000 r/min离心5min收集菌体。用PBS洗涤菌体3次后,加人600L提取液,菌
体经超声破碎(超停各2s,共9次)后,4℃下离心(12000r/min,10min)取上清液。残渣使用上述方法
重复提取1次(不需要超声破碎)后,合并2次上清液,在真空下除去有机溶剂。再次离心(4"℃,
12000r/min,10min)后,移取550uL上清液至5 mm NMR核磁管中进行分析
2.2.3NMR实验所有的NMR谱均在298K下采集,对应的质子共振频率为600.13MHz。使用标准
的 Nocsyprid脉冲序列(RD-90°-t1-90°-tm-90- acquisition)采集一维HNMR谱。在该序列中的等待时
间(RD,2s)和混合时间(tm,100ms)施加强度约50Hz的低功率连续波进行水峰抑制。每一个样品的
90°脉冲宽度均设置约10us。谱宽设置为20ppm,采样点数32k,FID累加64次。在傅里叶变换之前,将
所有一维HNMR谱的FID乘以增宽因子为1.0Hz的指数窗函数,再以手动方式进行相位和基线校正。
为了对NMR信号进行归属,采集选定样品的' HH COSY,"H-' H TOCSY,'HJ分解谱、H1 C HSQC
和' H-C HMBC等一系列2DNMR谱列。在COSY和 LTOCSY实验中,采样点数分别为200(F1)和
2048(F2),间接采样维F1和直接采样维F2的谱宽设置均为6313Hz,每一条FID累加64次。 TOCSY实验
选用MLEV17组合脉冲进行自旋锁定,混合时间为80ms。在HJ分解谱实验中,采样点数为48(F1)和
4096(F2),谱宽分別为60Hz(F1)和6313Hz(F2)。经傅立叶变换、零填充后,所得数据矩阵为4096×64,每
条FD累加64次。HC相关谱实验选用脉冲梯度场选择的HSQC和HMBC序列。HSQC实验在采样期
间用组合脉冲(GARP)对C信号去偶,在128条FID(F1)中每条采样点数为2048(F2),H与C两维的
谱宽分别为6313Ilz(F2)和26410Hz(F1),每一条FID累加400次。HMBC实验中远程偶合常数采用
6Hz,在128条FID(F1)中每条采样点数为2048