LS_T 6146-2023 粮油检验 粮食中霉菌计数 荧光快速检测法.pdf

I C S6 7.0 6 0C C SX0 4中华人民共和国粮食行业标准L S/T6 1 4 62 0 2 3粮油检验 粮食中霉菌计数荧光快速检测法I n s p e c t i o no f g r a i na n do i l sE n u m e r a t i o no fm o l d s i ng r a i nF l u o r e s c e n c e r a p i dd e t e c t i o nm e t h o d2 0 2 3-1 1-1 4发布2 0 2 4-0 5-1 4实施国家粮食和物资储备局发 布中 国 标 准 出 版 社出 版前 言 本文件按照G B/T1.12 0 2 0 标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则 的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由国家粮食和物资储备局提出。本文件由全国粮油标准化技术委员会(S A C/T C2 7 0)归口。本文件起草单位:国家粮食和物资储备局科学研究院、国家粮食和物资储备局标准质量中心、山东省粮油检测中心、中国储备粮管理集团有限公司仓储管理部、河北省粮油质量检测和信息服务中心、天津海关动植物与食品检测中心、吉林省粮油卫生检验监测站、广东省粮食和物资储备保障中心、安徽省粮油产品质量监督检测站、云南省粮油科学研究院(云南省粮油产品质量监督检验测试中心)、山西省检验检测中心(山西省标准计量技术研究院)、陕西省粮食质量安全中心、青岛元信检测技术有限公司、天祥(天津)质量技术服务有限公司青岛分公司、农业农村部食物与营养发展研究所。本文件主要起草人:崔华、王松雪、谢刚、王培、李克强、郭玉婷、王静、檀军锋、李森、张宏伟、赵良娟、张月、张建桥、石家源、王亚军、朱启思、胡斌、刘付英、王学政、王友凯、王丽华、宋泽伟、赵荔、高璐斐、韩娟。L S/T6 1 4 62 0 2 3粮油检验 粮食中霉菌计数荧光快速检测法1 范围本文件规定了粮食中霉菌计数荧光快速检测法的试剂与材料、仪器与设备、操作步骤、结果计算与报告、废弃物处理。本文件适用于粮食及其制品中霉菌的计数。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。G B/T6 6 8 2 分析实验室用水规格和试验方法G B1 9 4 8 9 实验室 生物安全通用要求3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1霉菌计数 e n u m e r a t i o no fm o l d s样品经过处理,在一定条件下经培养后所得1g样品中霉菌的数量。3.2菌落形成单位 c o l o n y-f o r m i n gu n i t;C F U由单个菌体或聚集成团的多个菌体在固体培养基上生长繁殖所形成的集落。4 原理样品稀释液通过滤膜后,霉菌被截留在滤膜表面,经培养基放大培养后,荧光试剂中不发光的酶底物进入霉菌体内并发生酶解反应,底物将发光基团释放到霉菌的细胞质中,发光基团在细胞内累积后,霉菌菌落在激发光线作用下被激发而显示荧光。5 试剂与材料除另有说明外,试验用水应符合G B/T6 6 8 2中三级水的规格。5.1 改良霉菌培养基:见附录A中A.1。5.2 生理盐水:见A.2。5.3 荧光显色液:见A.3。5.4 无菌均质袋或锥形瓶:容量2 5 0m L。1L S/T6 1 4 62 0 2 35.5 广口锥形瓶:容量1L或5 0 0m L。5.6 试管:1 8mm1 8 0mm。5.7 无菌吸管:1m L(具0.0 1m L刻度)、1 0m L(具0.1m L刻度)或移液器及枪头。5.8 无菌镊子。5.9 无菌培养皿:直径9 0mm。5.1 0 无菌疏水栅格滤膜:孔径0.4 5m,直径4 7mm。5.1 1 带垫片培养皿:直径5 0mm。6 仪器与设备6.1 谷物粉碎机:电机转速10 0 0r/m i n,粉碎粒径1mm。6.2 天平:感量0.1g。6.3 荧光检测仪:光源激发波长范围包含4 9 0n m,并含有截止波长为4 2 0n m的光学滤镜。6.4 拍击式均质器或振荡器。6.5 涡旋混合器。6.6 过滤器:5 0m L滤杯体积2 5 0m L。6.7 真空泵。6.8 培养箱:2 81。6.9 灭菌锅。7 操作步骤7.1 样品制备7.1.1 将样品用谷物粉碎机磨细至粒径小于1mm(全部通过1mm孔径的试验筛),充分混匀。7.1.2 准确称取2 5g粉碎试样(精确至0.1g),置于含有2 2 5m L无菌生理盐水(5.2)的锥形瓶(5.4)中,盖好瓶塞,放置到振荡器(6.4)中振荡3 0m i n(振荡幅度以样品全部摇起为有效);或置于无菌均质袋(5.4)中,加入2 2 5m L无菌生理盐水,用拍击式均质器(6.4)高速拍打2m i n,制成11 0样品稀释液。7.1.3 用无菌吸管(5.7)吸取1m L11 0样品稀释液注入含有9m L无菌生理盐水的试管(5.6)中,用涡旋混合器(6.5)混匀,即为1:1 0 0样品稀释液。7.1.4 按照7.1.3规定的操作程序制备1 0倍系列稀释样品稀释液。每递增稀释一次,更换一次无菌吸管或移液器枪头(5.7)。7.2 样品过滤7.2.1 根据对样品污染状况的估计,选择23个适宜稀释液的样品稀释液进行过滤,每个稀释液吸取1m L,注入含有9m L无菌生理盐水的试管中,用涡旋混合器混匀,每个稀释液重复2次上述操作。同时,准备2管1 0m L无菌生理盐水作为空白对照。7.2.2 用无菌镊子(5.8)夹取无菌疏水栅格滤膜(5.1 0)边缘部分,将网格面向上贴放在过滤器(6.6)的滤床上,固定好滤杯,将试管中的样品稀释液转移至滤杯中,打开真空泵(6.7)进行抽滤,抽滤完后再用1 0m L左右无菌生理盐水冲洗试管后倒入滤杯中,打开真空泵抽滤,待试液抽滤完后再抽气约5s后关闭真空泵。7.3 滤膜培养用无菌镊子夹住滤膜边缘从过滤器中取出,转移到改良霉菌培养基(5.1)中,将网格面朝上,先将滤2L S/T6 1 4 62 0 2 3膜一边接触培养基后再缓慢下放,使二者紧密贴合,中间不能有气泡。盖好皿盖后将培养皿倒扣放入培养箱(6.8)中,于2 81培养2 4h3h。7.4 菌落计数用无菌镊子从改良霉菌培养基中取出滤膜,将网格面朝上转移到含有1.5m L荧光显色液(5.3)的带垫片培养皿(5.1 1)中,盖好皿盖后将培养皿倒扣放入培养箱中,于2 81培养3 0m i n后,将培养皿口朝上置于荧光检测仪(6.3)的采集平台上,通过观察窗对荧光菌落进行观察并计数。注:使用不同厂家的荧光显色液和荧光检测仪时在操作方面会有区别,按照其使用说明要求进行操作。8 结果计算与报告8.1 总则选取霉菌总数在1 0C F U1 5 0C F U的滤膜进行计算,将同一稀释度的两个滤膜霉菌总数取平均值,再乘以相应的稀释倍数,以C F U表示霉菌的总数。8.2 结果计算8.2.1 当霉菌总数均在1 0C F U1 5 0C F U之间时,按式(1)计算:N=C(n1+0.1n2)d(1)式中:N 样品霉菌数;C 两个连续稀释度的所有平板霉菌数之和;n1 低稀释倍数滤膜个数;n2 高稀释倍数滤膜个数;d 低稀释度稀释因子。公式应用范例见附录B。8.2.2 在无法通过重新选择样品稀释度来优化霉菌总数均为1 0C F U1 5 0C F U的情况下,按照以下方式进行计算:a)当霉菌总数均小于1 0C F U时,按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算;b)当霉菌总数均大于1 5 0C F U时,按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数计算;c)其中一部分小于1 0C F U或大于1 5 0C F U时,按接近1 0C F U或1 5 0C F U的平均菌落数乘以相应稀释倍数计算;d)当霉菌总数均为0时,以小于1乘以最低稀释倍数计算。8.3 报告8.3.1 霉菌数小于1 0 0C F U时,以整数报告。8.3.2 霉菌数大于或等于1 0 0C F U时,取前2位数字,后面用0代替位数或者用1 0的指数形式来表示。8.3.3 若所有滤膜上为蔓延菌落而无法计数,则报告菌落蔓延。8.3.4 若空白对照上有菌落生长,则此次检测结果无效。8.3.5 以C F U/g为单位报告。3L S/T6 1 4 62 0 2 39 废弃物处理检测过程中的废弃物按照G B1 9 4 8 9的相关要求进行处理。4L S/T6 1 4 62 0 2 3附 录 A(资料性)培养基与试剂A.1 改良霉菌培养基A.1.1 成分麦芽浸粉 3 0.0g葡萄糖2 0.0g大豆蛋白胨5.0g酵母粉2.0g磷酸二氢钾1.0g硫酸镁0.5g琼脂2 0.0g维生素B20.0 0 5g氯霉素0.1g蒸馏水10 0 0m LA.1.2 配制方法除琼脂和维生素B2以外,准确称量其他各成分置于烧杯中,加入适量蒸馏水,搅拌至完全溶解,补足蒸馏水至10 0 0m L,加入琼脂,于1 2 11灭菌1 5m i n,待冷却至4 6(可放置于4 61水浴锅中保温),加入1m L维生素B2溶液(5m g/m L,用无菌生理盐水配制,现配现用),混匀后倾注1 5m L2 0m L至每个无菌培养皿(5.9)中,待凝固后置4冰箱内保存备用(储存时间不宜超过2周)。A.2 生理盐水A.2.1 成分氯化钠8.5g蒸馏水10 0 0m LA.2.2 配制方法称取8.5g氯化钠溶于适量蒸馏水中,搅拌至完全溶解,定容至10 0 0m L,分装后,1 2 11灭菌1 5m i n后备用。A.3 荧光显色液A.3.1 成分5(6)-羧基荧光素二乙酸酯0.1 5m g十二烷基-D-麦芽糖苷0.2g甘氨酸0.0 1g-聚赖氨酸0.0 1g5L S/T6 1 4 62 0 2 3A.3.2 配制方法称取0.2g十二烷基-D-麦芽糖苷、0.0 1g甘氨酸和0.0 1g-聚赖氨酸,用1 0 0m L无菌水充分溶解后,无菌条件下用0.2 2m滤膜过滤除菌,即为荧光显色缓冲液;准确称取0.1 5m g5(6)-羧基荧光素二乙酸酯,用3 0L二甲基亚砜溶解后加入荧光显色缓冲液中,即为荧光显色液,4储存备用(储存时间不宜超过2周)。6L S/T6 1 4 62 0 2 3附 录 B(资料性)公式应用范例 两个连续稀释度的所有滤膜霉菌数均在1 0C F U1 5 0C F U之间,结果见表B.1。表B.1 计算范例稀释度低稀释度11 0 0(1 0-2)高稀释度110 0 0(1 0-3)霉菌数(C F U)1 3 2/1 2 61 6/1 8N=C(n1+0.1n2)d=1 3 2+1 2 6+1 6+1 8(2+0.12)1 0-2=1 32 7 2C F U 数字修约后,表示为1.31 04,报告为1.31 04C F U/g。L S/T6 1 4 62 0 2 3