JJF 1974-2022 生物降解试验中接种物活性定量测量方法 高清晰版.pdf

中华人民共和国国家计量技术规范J J F1 9 7 42 0 2 2生物降解试验中接种物活性定量测量方法Q u a n t i t a t i v eM e a s u r e m e n tM e t h o df o rA c t i v i t yo fI n o c u l u mi nB i o d e g r a d a t i o nT e s t s 2 0 2 2-0 6-2 8发布2 0 2 2-1 2-2 8实施国 家 市 场 监 督 管 理 总 局 发 布学兔兔 标准下载生物降解试验中接种物活性定量测量方法Q u a n t i t a t i v eM e a s u r e m e n tM e t h o df o rA c t i v i t yo f I n o c u l u mi nB i o d e g r a d a t i o nT e s t sJ J F1 9 7 42 0 2 2 归 口 单 位:全国生物计量技术委员会 起 草 单 位:上海市检测中心中国计量科学研究院生态环境部固体废物与化学品管理技术中心 本规范委托全国生物计量技术委员会负责解释J J F1 9 7 42 0 2 2学兔兔 标准下载本规范起草人:陈晓倩(上海市检测中心)王 晶(中国计量科学研究院)傅博强(中国计量科学研究院)杨希晨(上海市检测中心)刘亚楠(上海市检测中心)唐治玉(中国计量科学研究院)杨 力(生态环境部固体废物与化学品管理技术中心)J J F1 9 7 42 0 2 2学兔兔 标准下载目 录引言()1 范围(1)2 引用文件(1)3 术语和计量单位(1)4 概述(2)5 测量条件(2)5.1 环境条件(2)5.2 仪器(2)5.3 试剂(2)5.4 材料(2)6 测量方法(3)6.1 标准曲线的建立(3)6.2 样品制备(3)6.3 样品的活性定量(4)6.4 测量重复性的计算(4)7 质量控制(4)8 不确定度的评定及表述(5)附录A 试验溶液的配制(6)附录B 生物降解试验中接种物活性定量测量应用实例(8)附录C 原始记录格式(推荐性表格)(1 3)附录D 测试报告内页推荐格式(1 5)J J F1 9 7 42 0 2 2学兔兔 标准下载引 言本规范依据J J F1 0 7 12 0 1 0 国家计量校准规范编写规则、J J F1 0 0 12 0 1 1 通用计量术语及定义和J J F1 0 5 9.12 0 1 2 测量不确定度评定与表示制定,主要参考A S TM D 4 0 1 21 5 水中微生物三磷酸腺苷(A T P)含量标准检测方法 S t a n d a r dT e s tM e t h o df o rA d e n o s i n eT r i p h o s p h a t e(A T P)C o n t e n to fM i c r o o r g a n i s m s i nW a t e r和J J F1 8 2 82 0 2 0A T P荧光检测仪校准规范制定。本规范为首次发布。J J F1 9 7 42 0 2 2学兔兔 标准下载生物降解试验中接种物活性定量测量方法1 范围本规范适用于环境风险评估中生物降解试验所使用的接种物活性的定量测量。2 引用文件本规范引用了下列文件:J J G1 9 6 常用玻璃量具J J F1 1 3 5 化学分析测量不确定度评定J J F1 2 6 5 生物计量术语及定义J J F1 8 2 8 A T P荧光检测仪校准规范H J/T1 5 3 化学品测试导则O E C D3 0 1 化学品测试准则(G u i d e l i n e s f o r t h eT e s t i n go fC h e m i c a l s)A S TMD 4 0 1 2 水中微生物三磷酸腺苷(AT P)含量标准检测方法 S t a n d a r dT e s tM e t h o df o rA d e n o s i n eT r i p h o s p h a t e(A T P)C o n t e n to fM i c r o o r g a n i s m s i nW a t e r凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本规范;凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本规范。3 术语和计量单位J J F1 1 3 5、H J/T1 5 3和O E C D中界定的及以下术语和定义适用于本规范。3.1 生物降解试验 b i o d e g r a d a t i o nt e s t评估受试物被接种物(一般含微生物)分解为C O2、水、矿物盐和新的细胞代谢物的能力的试验。3.2 接种物 i n o c u l u m生物降解试验过程中用于接种的含有活性微生物的试验生物,包括地表水、生活污水处理厂二级出水、生活污水处理厂活性污泥等中的微生物群落。3.3 微生物群落 m i c r o b i a l c o mm u n i t y在特定环境下生长的不同种的微生物,在生理和生存过程中具有一定的联系,通过它们之间相互作用,使群体协调发展,并且具有一定功能的微生物的组合。3.4 相对光单位 r e l a t i v e l i g h tu n i t,R L U三磷酸 腺 苷(A d e n o s i n eT r i p h o s p h a t e,AT P)水 解 成 一 磷 酸 腺 苷(A d e n o s i n eM o n o p h o s p h a t e,AMP)和焦磷酸盐时释放化学能驱动荧光素在荧光素酶催化下氧化释放的光量子数的测量单位。注:非S I单位,但与AT P浓度成比例关系。不同的检测仪对于同样的样品可能会产生不同的R L U读数。1J J F1 9 7 42 0 2 2学兔兔 标准下载4 概述生物降解性用于评估化学物质与接种物接触表现出被生物降解的潜力,是鉴定化学物质的环境危害性和持久性、进行分类和标签、评价和控制环境风险的基本指标。接种物活性是生物降解性中的主要内容。通过接种物活细胞数量的多寡反映微生物能量代谢的活性,判断其活性是否符合生物降解试验的要求,作为接种物影响生物降解结果的指标。本规范采用A T P法测量接种物中的活细胞浓度。A T P法是将接种物中的A T P经提取后,测量在氧气、A T P和镁离子同时存在下荧光素酶催化荧光素氧化产生的5 5 0 n m黄绿色光强度。在一定范围内,光强度与A T P浓度成正比例关系。光强度用发光检测仪(如A T P荧光检测仪、微孔板化学发光检测仪等)测量,结果用相对光单位(R L U)表示。根据相对光单位强度可以推算出接种物中的A T P浓度(n m o l/L)。通常每个微生物细胞中的AT P含量相对恒定,约(51 0-1 651 0-1 5)gAT P/c e l l或(1 0-91 0-8)n m o lA T P/c e l l,由此可以计算得到接种物中的活细胞浓度。5 测量条件5.1 环境条件温度:(1 92 7)。5.2 仪器5.2.1 发光检测仪:检测范围不低于4个数量级,线性误差小于1 0%。5.2.2 移液器:(11 0)L,(1 01 0 0)L或(2 02 0 0)L,(1 0 010 0 0)L各1支。5.2.3 电子天平:分度值为0.0 1m g。5.2.4 高速大容量离心机:离心力不低于11 0 0g。5.2.5 水分仪:分度值为0.1m g。5.3 试剂5.3.1 5 -三磷酸腺苷(A T P)二钠盐纯度标准物质(以下简称A T P二钠盐):扩展不确定度1%(k=2)。5.3.2 A T P标准工作液:配制见附录A.2。5.3.3 A T P检测试剂:主要包括AT P提取剂、荧光素和荧光素酶。注:建议使用含有AT P提取剂的商业化AT P检测试剂盒,具体实施依据试剂生产厂家的要求实施。5.3.4 高压灭菌水或无菌水:无菌、无A T P。5.3.5 矿质培养基:详见附录A.1。5.4 材料5.4.1 无菌塑料离心管:(25 0 0)m L。5.4.2 不透光的9 6孔板或其他与发光检测仪适配的器皿。2J J F1 9 7 42 0 2 2学兔兔 标准下载6 测量方法6.1 标准曲线的建立6.1.1 配制A T P标准工作液,应设置至少5个不同的浓度,如0.1n m o l/L、1n m o l/L、1 0n m o l/L、1 0 0n m o l/L、10 0 0n m o l/L,也可根据实际情况设置浓度范围。移液器分别移取A T P标准工作液,与荧光素-荧光素酶混合试剂混合反应。6.1.2 用发光检测仪检测并记录相对光强度。每个浓度AT P标准工作液设定3个平行,以3次测量的相对光强度的平均值作为该浓度A T P标准工作液的平均相对光强度。6.1.3 以平均相对光强度(y)和A T P标准工作液的浓度(x)绘制标准曲线,进行线性拟合,得到标准曲线方程式(1)。按式(2)计算线性相关系数r,取r0.9 9 5的浓度范围作为线性范围。若r0.9 9 5时,则去掉最高浓度点,再增加0.5倍最高浓度点,与余下的浓度点重新绘制标准曲线,直至r0.9 9 5。y=ni=1(xi-x)(yi-y)ni=1(xi-x)2x+y-ni=1(xi-x)(yi-y)ni=1(xi-x)2x(1)r=ni=1(xi-x)(yi-y)ni=1(xi-x)2ni=1(yi-y)2(2)式中:r 线性相关系数;xi 第i个测量点的A T P标准工作液浓度,n m o l/L;x 用于计算线性范围的测量点的A T P标准工作液浓度的平均值,n m o l/L;yi 第i个测量点的平均相对光强度,R L U;y 用于计算线性范围的测量点的相对光强度的平均值,R L U;n 用于计算线性范围的测量点的个数。6.2 样品制备6.2.1 生物降解试验中的接种物可以有多种来源,包括活性污泥、污水处理厂二级出水、地表水或这几种的混合物。当接种物为活性污泥或多种接种物的混合物时,可利用离心法(以11 0 0g的离心力离心1 0m i n)或沉降法(自然沉淀后倒去上清液)等预处理方法去除表面杂质,用矿质培养基(5.3.5)进行清洗至少3次。用水分仪(试验条件为1 0 5,1h)测定干重,用培养基配制成浓度适宜的悬液作为待测样品(详见附录B.2)。当接种物为污水处理厂二级出水时,可沉淀1h或用粗滤纸过滤,取上清液或滤出液作为待测样品。当接种物为地表水时,如有必要,可通过过滤或离心将接种物浓缩作为待测样品。6.2.2 还可使用商业化接种物作为生物降解试验的接种物,具体配制方法可参照商品3J J F1 9 7 42 0 2 2学兔兔 标准下载使用说明书或其他相关作业指导书。6.2.3 应在样品制备完成后保存在(28),并在2 4h内完成样品A T P浓度的测量。6.3 样品的活性定量6.3.1 移液器量取样品溶液,加入A T P提取剂处理,释放A T P。6.3.2 加入荧光素-荧光素酶混合试剂,充分混合反应。注:步骤6.3.1和6.3.2可依据试剂生产厂家规定的使用要求进行调整。6.3.3 用发光检测仪测量并记录相对发光强度。6.3.4 步骤6.3.1至6.3.2重复6次,将6次测量的相对发光强度的平均值作为样品的平均相对发光强度,代入式(1)中,计算得到样品A T P浓度的测量值。6.3.5 按式(3)计算样品中活细胞浓度的范围。Cc e l l=xV1aV(3)式中:Cc e l l 活细胞浓度,L-1;x 样品A T P浓度的测量值,n m o l/L;V1 样品稀释后总体积,L;V 样品体积,L;a 每个活细胞中的A T P含量的理论值,1 0-9n m o l 1 0-8n m o l。6.4 测量重复性的计算以6.3.3中样品6次测量结果的相对标准偏差(R S D值)表示的测量重复性,按式(4)计算。R S D=1yni=1(yi