【发明专利】一种人工修饰3D光交联探针及钓取中草药活性小分子合成酶的方法 CN114460047A.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202111565303.4(22)申请日 2021.12.20(71)申请人 上海中医药大学地址 201203 上海市浦东新区蔡伦路1200号(72)发明人 贺庆利庄铮赵群飞林国强(74)专利代理机构 上海唯智赢专利代理事务所(普通合伙) 31293专利代理师 吴瑾瑜(51)Int.Cl.G01N 21/63(2006.01)C08F 251/00(2006.01)C08F 220/20(2006.01)C08F 220/28(2006.01)C08B 37/12(2006.01)C08F 8/10(2006.01)C08F 8/30(2006.01)C09K 11/06(2006.01) (54)发明名称一种人工修饰3D光交联探针及钓取中草药活性小分子合成酶的方法(57)摘要本发明属于生物医药领域， 具体涉及一种利用人工修饰3D光交联探针， 在纳米微球表面修饰引发剂， 加入单体， 通过原子转移自由基聚合反应(ATRP)在纳米微球上合成不同数量的、 有一定长度的链， 从而形成3D结构， 能够增加小分子的固定位点， 从而增强钓取蛋白靶点的成功率， 更加准确地确定靶标蛋白。 进一步连接光交联官能团， 使之能与活性小分子连接， 用于钓取中草药活性小分子合成酶。 本发明可以实现在复杂的蛋白背景中， 鉴别中草药活性小分子未知的蛋白靶点， 为最终实现中药活性分子的微生物合成奠定坚实的基础。权利要求书2页 说明书8页 附图2页CN 114460047 A2022.05.10CN 114460047 A1.一种人工修饰3D光交联探针， 其特征在于， 以纳米微球为基体， 修饰有以下基团：其中R为光交联官能团， m215， n215。2.根据权利要求1所述的所述的人工修饰3D光交联探针， 其特征在于， 所述光交联官能团为二苯甲酮、 芳基叠氮化物或双吖丙啶基团。3.根据权利要求1或2所述的所述的人工修饰3D光交联探针， 其特征在于， 所述的纳米微球为琼脂糖树脂、 四氧化三铁纳米微球或金纳米微球。4.权利要求13任一项所述人工修饰3D光交联探针的制备方法， 其特征在于， 包括以下步骤：A.在修饰有羧基类末端的纳米微球上通过酰胺缩合连接乙二胺； 所述的羧基类末端为羧基、 羧甲基或羧基甲氧基；B.步骤A产物与卤代异丁酸进行酰胺缩合反应， 将引发剂基团NHCOC(CH2)2X修饰在纳米微球上， 得到带有引发剂的纳米微球； X为Cl或Br；C.带有引发剂的纳米微球与化合物羟基丙烯酸酯、 聚乙二醇烯类单体进行表面聚合反应， 得到带有羟基末端的3D材料， 是修饰的纳米微球；D.将步骤C带有羟基末端的3D材料与丁二酸酐、 4二甲氨基吡啶反应， 将羧基连接到3D材料上， 得到修饰的纳米微球；E.活化步骤D产物的羧基， 再与光交联剂反应， 最终得到人工修饰的3D光交联探针。5.根据权利要求4所述的的制备方法， 其特征在于， 步骤A、 B所述的酰胺缩合反应中所用的缩合剂为O苯并三氮唑四甲基脲六氟磷酸盐、 1羟基苯并三唑、 N,N二异丙基乙胺混合物， 以N,N二甲基甲酰胺为溶剂。6.根据权利要求4所述的制备方法， 其特征在于， 步骤C中， 所述表面聚合反应的步骤为：将步骤B所得带有引发剂的纳米微球与含有机还原剂、 聚合反应催化剂、 羟基丙烯酸酯和PEG的烯类单体的溶液， 在无氧环境下进行单体聚合反应即得；所述有机还原剂为葡萄糖、 抗坏血酸或辛酸亚锡或二硫苏糖醇或三(2羧乙基)膦；所述聚合反应催化剂为过渡金属盐和鳌合剂的混合物；所述的羟基丙烯酸酯类单体为甲基丙烯酸羟乙酯或丙烯酸羟丙酯或4羟基丁基丙烯酸酯， 所述的PEG烯类单体为聚乙二醇甲基丙烯酸酯。权利要求书1/2 页2CN 114460047 A27.根据权利要求4所述的制备方法， 其特征在于， 步骤E中， 将步骤C处理后的纳米微球用NHS、 EDCl活化羧基， 加入含有光交联剂和有机碱类催化剂的溶液反应， 再加入羧基封闭剂；所述的交联剂选自二苯甲酮、 芳基叠氮化物或双吖丙啶类化合物。8.权利要求13任一项所述的人工修饰3D光交联探针在钓取中草药活性小分子合成酶或标靶蛋白方面的应用。9.一种钓取中草药活性小分子合成酶的方法， 其特征在于， 包括以下步骤：(1)取权利要求13任一项所述人工修饰3D光交联探针， 通过光交联将中草药活性小分子与人工修饰3D光交联探针连接， 得到3D探针；(2)将植物来源总蛋白破碎液与3D探针孵育， 进行小分子合成酶即蛋白靶点的钓取；(3)孵育后， 清洗钓取蛋白标靶之后的3D探针；(4)检测和表征蛋白。10.根据权利要求9所述的方法， 其特征在于， 步骤(3)中用不会影响小分子与靶标蛋白特异性结合的溶液或溶剂进行清洗， 包括有机溶剂或缓冲液； 有机溶剂为四氢呋喃、 乙腈或二甲基亚砜， 缓冲液为磷酸盐水溶液。权利要求书2/2 页3CN 114460047 A3一种人工修饰3D光交联探针及钓取中草药活性小分子合成酶的方法技术领域0001本发明属于生物医药领域， 具体涉及一种利用人工修饰3D材料及智能钓取中草药活性小分子合成酶的方法。背景技术0002中药来源的小分子很多具有良好而独特的活性， 一直是药物开发的重要源泉之一。 传统获取植物天然产物的方法是植物提取， 这种传统的生产模式有较多缺点， 如在宿主中含量比较低且差异大， 植物本身生长周期长， 且这一方式严重依赖于植物资源的获取和消耗。 在化学合成方面， 存在着合成路线长、 总产率低和经济性差等问题， 而且在化学合成中所用的有机试剂容易造成污染， 某些反应还需要昂贵的重金属催化剂等， 难以实现产业化。0003通过合成生物学技术， 在微生物细胞中快速高效地获得珍稀植物的稀有活性成分， 为植物源天然产物的研究和开发、 降低药物的生产成本以及植物资源的可持续利用和发展， 开辟了一条全新而高效的途径。 合成生物学的成功应用必须基于对天然产物生物合成途径的深入了解。 相比微生物， 由于基因组庞大， 生物合成基因簇通常不连锁等原因， 导致植物来源天然产物的生物合成解析非常困难， 一些具有重大商业价值的著名分子， 如紫杉醇、 青蒿素等的合成途径至今还未被完全解析。 其主要原因在于缺少行之有效的发现催化活性天然产物中独特结构单元形成反应的新型酶的方法。 因此发展一套行之有效的全新的策略来定位植物中合成天然产物的酶， 具有很大的研究意义。0004药物靶标是指体内具有药效功能并能被药物作用的生物大分子， 绝大多数为蛋白。 包括多种受体、 酶等。 小分子和其作用靶标之间存在相互作用， 这一特性被广泛地应用于鉴定小分子蛋白靶点。 传统的化学生物学的方法鉴定蛋白的靶点， 主要策略是通过小分子化学衍生， 将其通过化学键共价偶联到特定的基质上， 由于小分子与蛋白靶标的相互作用， 蛋白靶点会在固定小分子的基质上得到富集。 但是这种单一位点的衍生， 往往会造成化合物的活性消失， 从而造成靶点鉴定实验的失败。 酶与小分子底物或产物的相互作用是动态的， 而且完全未知的酶与小分子作用模式也完全未知， 如果用定点位置衍生的小分子底物或产物的策略， 成功获取催化反应的酶的概率会相对较低。0005有文献报道， 日本理化研究所的Osada及其合作者在高分子填料上固定高反应活性的双吖丙啶基团， 在365nm的紫外光的照射下， 其产生的卡宾能够近乎随机的插入O/N/SH和CH键和临近的小分子结构相连接， 这样小分子会以各种不同的方向固定在填料上， 方便蛋白靶点的鉴定。 通过构建基于卡宾光交联技术的小分子阵列， Osada等人利用荧光强度的方法检测了Biotin、 Rapamycin等多个小分子与其靶标或抗体的特异性结合。 但小分子往往固定在一个二维(2D)的材料表面， 可能会由于拥挤的表面， 而造成蛋白鉴定的失败。0006表面化学的发展为上述问题的解决提供了新的思路。 三维表面化学在近些年为生物分子相互作用的检测芯片提供了丰富的改进空间。 三维表面化学,如葡聚糖表面化学、 水说明书1/8 页4CN 114460047 A4凝胶表面化学、 表面引发聚合表面化学等技术， 在为小分子的固定提供大量固定位点并拓展相互作用检测空间的同时,也在很大程度上提高了表面对分析物的抗非特异性吸附能力。 其中， 原子转移自由基聚合反应(ATRP)是以简单的有机卤化物为引发剂、 过渡金属配合物为卤原子载体， 通过氧化还原反应， 在活性种与休眠种之间建立可逆的动态平衡， 从而实现了对聚合反应的控制。0007最近有文献报道， 约翰霍普金斯大学刘钧教授课题组， 利用ATRP聚合反应， 合成了一个高通量筛选的小分子微阵列， 并比较了2D和新开发的3D表面在相同条件下结合FKBP12的能力， 结果表明FKBP12在3D表面上结合的信号背景比， 比2D表面上的大6倍， 表明新开发的3D芯片是筛选目标蛋白的绝佳平台。 并用此3D微阵列发现一种有效的葡萄糖转运蛋白抑制剂RgA。0008因此， 我们可以借鉴上述方法将小分子底物或产物， 固定在人工修饰的三维高分子材料的表面， 用于鉴定植物来源的催化特定反应的酶， 发展一套全新的钓取中草药活性小分子合成酶的方法。发明内容0009本发明的目的是针对现有技术存在的问题， 提供一种利用人工修饰3D材料智能钓取中草药活性小分子合成酶的方法。 本发明不仅可以实现在复杂的蛋白背景中， 筛选出已知活性小分子的蛋白靶点， 还能尝试鉴别中草药活性小分子未知的蛋白靶点， 为最终实现中药活性分子的微生物合成奠定坚实的基础。0010为实现上述目的， 本发明采用以下技术方案：0011一种人工修饰3D光交联探针， 以纳米微球为基体， 修饰有以下基团：0012其中R为光交联官能团， m215， n215， 优选的， m510， n510。0013所述的光交联官能团为二苯甲酮、 芳基叠氮化物或双吖丙啶基团， 优选为三氟甲基苯基双吖丙啶基团。0014制备方法包括以下步骤：0015A.修饰有羧基类末端的纳米微球上连接乙二胺； 所述的羧基类末端为羧基、 羧甲基、 羧基甲氧基； 所述的纳米微球为琼脂糖树脂、 四氧化三铁纳米微球或金纳米微球；0016B.步骤A产物与卤代异丁酸进行酰胺缩合反应， 将引发剂基团NHCOC(CH2)2X修饰在纳米微球上， 得到带有引发剂的纳米微球； X为Cl或Br， 优选为Br；0017C.带有引发剂的纳米微球与化合物羟基丙烯酸酯、 聚乙二醇烯类单体进行表面聚合反应， 得到带有羟基末端的3D材料， 是修饰的纳米微球：说明书2/8 页5CN 114460047 A5其中的m215， n215， 优选的， m510， n510；0018D.将步骤C带有羟基末端的3D材料与丁二酸酐、 4二甲氨基吡啶反应， 将羧基连接到3D材料上， 得到修饰的纳米微球；00190020E.活化步骤D产物的羧基， 再与光交联剂反应， 最终得到人工修饰的3D光交联探针。0021具体的， 步骤A中， 修饰有羧基类末端的纳米微球与带有保护基团的乙二胺进行酰胺缩合反应， 再脱保护基团， 得到OCH2CONHCH2CH2NH2修饰的纳米微球； 带有保护基团的乙二胺为优选的， 用哌啶脱Fmoc九芴甲氧羰基， 得到0022步骤A、 B所述的酰胺缩合反应中所用的缩合剂， 优选为， O苯并三氮唑四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、 1羟基苯并三唑(HOBT)和N,N二异丙基乙胺(DIEA)的混合物， 其摩尔比为1： 0.91.2： 2.53.5， 优选为1： 1： 3， 以N,N二甲基甲酰胺为溶剂。0023步骤C所述的表面引发的聚合反应是指先在纳米微球表面合成引发剂， 再通过氧化还原反应引发单体在表面聚合， 从而获得所谓的3D结构， 最后将可光交联基团连接到纳米微球表面。0024步骤C中， 所述表面聚合反应的步骤为：0025将步骤B所得带有引发剂的纳米微球与含有机还原剂、 聚合反应催化剂、 羟基丙烯酸酯和PEG的烯类单体的溶液， 在无氧环