【发明专利】一种肾阳虚证不孕模型的制备方法 CN114651789A.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202110991086.9(22)申请日 2021.08.26(66)本国优先权数据202010879900.3 2020.08.27 CN(71)申请人 成都中医药大学地址 610000 四川省成都市温江区柳台大道1166号 申请人 陆华(72)发明人 陆华刘奕董文然刘芊辰(74)专利代理机构 成都高远知识产权代理事务所(普通合伙) 51222专利代理师 李高峡张娟(51)Int.Cl.A01K 67/027(2006.01)G01N 33/15(2006.01)G01N 33/74(2006.01)C12Q 1/02(2006.01) (54)发明名称一种肾阳虚证不孕模型的制备方法(57)摘要本发明提供了一种肾阳虚证不孕模型的制备方法， 涉及一种动物模型的造模方法。 它是使用04羟基脲造模。 本发明利用冰羟基脲造模方法成功建立了肾阳虚证不孕模型。 该模型和羟基脲造模方法制备的模型相比， 造模时间更短，造模效果更好， 具有良好的应用前景。权利要求书1页 说明书7页CN 114651789 A2022.06.24CN 114651789 A1.一种肾阳虚证不孕模型的制备方法， 其特征在于： 它是使用04羟基脲造模。2.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于： 它是将04羟基脲施用于小鼠， 每日施用一次， 连续施用三周。3.根据权利要求2所述的制备方法， 其特征在于： 它是将剂量为400mg/kg的04羟基脲施用于小鼠， 每日施用一次， 连续施用三周。4.根据权利要求3所述的制备方法， 其特征在于： 它是将剂量为400mg/kg的4羟基脲施用于小鼠， 每日施用一次， 连续施用三周。5.根据权利要求14任一项所述的制备方法， 其特征在于： 所述羟基脲的施用方法是灌胃。6.根据权利要求5所述的制备方法， 其特征在于： 所述灌胃时将羟基脲溶于去离子水，冷冻后使用。7.根据权利要求14任一项所述的制备方法， 其特征在于： 所述小鼠为昆明雌性小鼠。8.权利要求17任一项所述的制备方法制备的肾阳虚证不孕模型在筛选治疗肾阳虚证不孕的药物中的用途。9.一种筛选治疗肾阳虚证不孕的药物的方法， 其特征在于： 它包括如下步骤：(1)按照权利要求17任一项所述的制备方法， 建立肾阳虚证不孕模型；(2)将候选药物施用于肾阳虚证不孕模型；(3)用肾阳虚证不孕模型评价潜在的治疗肾阳虚证不孕的药物。权利要求书1/1 页2CN 114651789 A2一种肾阳虚证不孕模型的制备方法技术领域0001本发明涉及一种动物模型的造模方法， 具体涉及一种肾阳虚证不孕模型的制备方法。背景技术0002阳虚质在不孕症中占比例较高， 有研究报道， 阳虚质所占比例最高病种为不孕症，提示阳虚质与不孕症发生关系密切， 而不孕女性中， 肾阳虚证候发生率占7.14。0003中医证候动物模型是中医科研体系的重要组成部分， 在中医基础理论研究和中药药理研究中发挥着重要作用。 目前中医证候动物模型研究已覆盖几乎所有的中医辨证领域， 在中医病理学、 药理学、 生理学研究中有日渐广泛的应用。0004肾阳虚证动物模型是建立最早的中医证候动物模型， 自第一个肾阳虚证动物模型建立以来， 以各种方法建立起来的肾阳虚模型现有的文献报道已有20余种。 目前肾阳虚证的动物模型从病因模型、 病理模型切入， 如依据中医理论从房劳、 老龄、 恐吓等方法进行病因造模， 以及运用激素抑制垂体前叶促肾上腺皮质激素释放、 高浓度腺嘌呤毒害肾脏和睾丸生殖细胞等机制进行病理造模。 但目前仍存在造模方法混乱、 致死率高、 周期不明确、 表征程度不一等问题。0005现有技术中， 使用羟基脲造肾阳虚证动物模型较多， 但是该造模方法仍然存在造模周期长、 成功率不高、 模型表征不突出等问题。 寻找一个新的造模方法制造肾阳虚证不孕模型， 减少造模周期、 提高成功率， 使模型表征更突出， 对于临床研究肾阳虚证具有重要意义。发明内容0006本发明的目的是提供一种肾阳虚证不孕模型的制备方法。0007本发明提供了一种肾阳虚证不孕模型的制备方法， 它是使用04羟基脲造模。0008进一步地， 前述的制备方法是将04羟基脲施用于小鼠， 每日施用一次， 连续施用三周。0009进一步地， 前述的制备方法是将剂量为400mg/kg的04羟基脲施用于小鼠， 每日施用一次， 连续施用三周。0010进一步地， 前述的制备方法是将剂量为400mg/kg的4羟基脲施用于小鼠， 每日施用一次， 连续施用三周。0011进一步地， 所述羟基脲的施用方法是灌胃。0012进一步地， 所述灌胃时将羟基脲溶于去离子水， 冷冻后使用。0013进一步地， 所述小鼠为昆明雌性小鼠。0014本发明还提供了前述的制备方法制备的肾阳虚证不孕模型在筛选治疗肾阳虚证不孕的药物中的用途。0015本发明还提供了一种筛选治疗肾阳虚证不孕的药物的方法， 它包括如下步骤：说明书1/7 页3CN 114651789 A30016(1)按照前述的制备方法， 建立肾阳虚证不孕模型；0017(2)将候选药物施用于肾阳虚证不孕模型；0018(3)用肾阳虚证不孕模型评价潜在的治疗肾阳虚证不孕的药物。0019本发明利用冰羟基脲造模方法成功建立了肾阳虚证不孕模型。 该模型和羟基脲造模方法制备的模型相比， 造模时间更短， 造模效果更好， 具有良好的应用前景。0020显然， 根据本发明的上述内容， 按照本领域的普通技术知识和惯用手段， 在不脱离本发明上述基本技术思想前提下， 还可以做出其它多种形式的修改、 替换或变更。0021以下通过实施例形式的具体实施方式， 对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。 但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。 凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。具体实施方式0022本发明具体实施方式中使用的原料、 设备均为已知产品， 通过购买市售产品获得。0023实施例1、 本发明肾阳虚证不孕模型的制备00241、 实验材料0025(1)实验动物： SPF级昆明雌性小鼠96只， 体重(255)g， 8周龄， 由达硕实验动物公司提供。0026(2)实验药物： 齐鲁制药有限公司羟基脲片， 每片0.5g， 批号9C043D05。 按照5mg/mL配置为羟基脲混悬液。 孕马血清(PMSG)， 规格： 1000iu5盒， 生产厂家： 北京索莱宝科技有限公司， 产品批号： 718E031。 注射用绒促性素(HCG)， 规格： 2000iu/支， 生产厂家： 丽珠集团丽珠制药厂， 产品批号： 11401010030C。0027(3)实验仪器与试剂： 主要实验试剂包括： 苏木素、 伊红、 无水乙醇、 95乙醇、 二甲苯、 多聚甲醛等。 实验器材及仪器： 吸卵管、 眼科镊、 眼科剪、 1ml空针、 35mm培养皿、 冻存管、移液枪、 移液枪头。 石蜡切片机、 恒温水浴锅、 光学显微镜、 徕卡显微成像系统、 切片刀、 盖玻片、 载玻片等。00282、 实验方法0029小鼠灌药剂量参照 药理学实验人和动物间按体表面积这算的等效剂量比率表 ， 结合预实验实际用药量确定。0030小鼠适应性饲养1周， 随机分别对照组、 冰水组、 羟基脲组、 冰羟基脲组4组， 每组24只。 羟基脲组使用温浴后(26)的羟基脲混悬液按照羟基脲400mg/kg的剂量灌胃， 每日1次， 连续四周； 冰羟基脲组给予等量4羟基脲混悬液灌胃(羟基脲的剂量也为400mg/kg)，每日1次， 连续三周； 冰水组给予等量4去离子水灌胃， 每日1次， 连续四周； 对照组不做干预。0031对照组： 不进行造模的小鼠；0032冰水组： 将去离子水冷冻至4；0033羟基脲组： 将羟基脲片用去离子水按照5mg/mL配置为羟基脲混悬液；0034冰羟基脲组： 将羟基脲片用去离子水按照5mg/mL配置为羟基脲混悬液， 然后冷冻至4。00353、 检测指标说明书2/7 页4CN 114651789 A40036(1)超促排卵及留取标本0037各组小鼠造模完成后给予PMSG+HCG超促排卵， 即第一天下午16:00腹腔注射PMSG 5IU， 48h后即第三天下午16:00腹腔注射HCG 5IU。 各组小鼠再分为4个小组：00381小组为标本A组(6只)， 于注射HCG后12小时取血及组织(子宫)；00392小组为合笼组(6只)， 于注射HCG后按照2： 1的比例与雄鼠合笼；00403小组为取卵组(6只)， 于注射HCG后16小时于显微镜下观察卵母细胞， 进行分期及计数；00414小组为标本B组(6只)， 于注射HCG后72小时取血、 取标本(卵巢)。0042小鼠采用目内眦采血法取血， 离心后取血清冻于20的冰箱待测。 取小鼠子宫，经10甲醛液固定， 制作HE染色片； 卵巢标本同法。0043(2)观察指标0044一般指标： 观察小鼠体重， 毛发， 自主活动， 反应迟钝， 弓背蜷缩， 尿量增多情况， 合笼情况；0045客观指标： 研究小鼠性激素水平， 子宫， 卵巢重量， 肛温， 卵泡数， HE染色。00464、 统计方法0047实验数据用Excel录入， SPSS软件进行分析， 计量资料结果以xs表示， 方差齐性多组间比较采用单因素方差分析， 方差不齐两组间比较采用t检验， p0.05为数据具有统计学差异， p0.01为数据有显著统计学差异。00485、 试验结果0049(1)各组小鼠一般情况0050如表1所示， 各组小鼠造模前体重无统计学差异， 造模后冰水组、 羟基脲组、 冰羟基脲组各组体重均显著低于对照组(p0.01)， 冰羟基脲模型组体重低于冰水模型组(p0.05)， 羟基脲模型组与冰羟基脲模型组体重无明显差异。0051表1.各组小鼠的体重00520053注：*与对照组比较， p0.01；0054与冰水组比较， p0.05。0055冰水组、 羟基脲组、 冰羟基脲组的各组小鼠除了均出现了体重降低， 还出现了毛发脱落， 自主活动减少， 反应迟钝， 弓背蜷缩， 尿量增多等阳虚表现。 结果说明三种方式造成的小鼠阳虚状态， 均造成其体重减轻， 其中， 冰羟基脲模型组体重的减轻最为显著。0056(2)各组小鼠肛温测定结果0057表2.各组小鼠肛温测定结果说明书3/7 页5CN 114651789 A500580059注： 与对照组比较，p0.05， p0.01。0060如表2所示， 各组造模前， 肛温无统计学差异； 各组造模后， 肛温均值冰羟基脲组羟基脲组冰水组对照组， 冰水组、 羟基脲组肛温低于对照组， 差异有统计学意义(p0.05)； 冰羟基脲组肛温显著低于对照组(p0.01)。 冰水组、 羟基脲组、 冰羟基脲组肛温组间比较无统计学差异。0061结果显示， 三种阳虚造模后， 小鼠肛温均有不同程度下降， 且与对照组相比差异有统计学意义。 但不同造模方式间， 肛温无明显差异。0062(3)各组小鼠子宫湿重及子宫指数0063表3.各组造模后的小鼠子宫湿重及子宫指数00640065注： 与冰水组比较， p0.01。0066如表3所示， 造模后各组子宫湿重比较， 数据无统计学差异。 子宫指数比较， 与冰水组比较， 冰羟基脲组子宫指数显著高于冰水组(p0.01)。0067结果显示， 各种阳虚造模方法对子宫湿重无明显影响。 而冰羟基脲组的子宫指数显著高于冰水组和羟基脲组。0068(4)各组小鼠性激素0069表4.各组小鼠性激素(单位pg/ml)00700071注： 与对照组比较，p0.05， p0.010072与冰水组比较，p0.05， p0.010073如表4所示， 对于小鼠性激素AMH均值， 冰羟基脲组羟基脲组冰水组对照组， 与对照组比较， 羟基脲组、 冰羟基脲组AMH均值显著低于对照组(p0.01)； 与冰水组比较， 羟基脲组、 冰羟基脲组AMH均值显著低于冰水组(p0.01)。说明书4/7 页6CN 114651789 A60074超促排卵12h后E2均值，