【发明专利】一种肾阳虚证动物模型生物标志物的筛选及确定方法 CN106645746A.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201611015606.8(22)申请日 2016.11.18(71)申请人 福建中医药大学地址 350003 福建省福州市鼓楼区五四路282号(72)发明人 苏友新郑乃熙郑良朴詹正烜赖兴泉黄露露朱亚菊(74)专利代理机构 福州元创专利商标代理有限公司 35100代理人 蔡学俊陈彩芳(51)Int.Cl.G01N 33/68(2006.01)G01N 27/447(2006.01)G01N 27/62(2006.01) (54)发明名称一种肾阳虚证动物模型生物标志物的筛选及确定方法(57)摘要本发明提供一种肾阳虚证动物模型生物标志物的筛选及确定方法； 具体包括样品松质骨总蛋白的提取、 蛋白浓度的测定、 双向凝胶电泳分析、 凝胶蛋白点的检测与差异蛋白点显示分析、差异蛋白的MALDI-TOF-MS质谱分析以及蛋白质数 据 库 检 索 及 鉴 定 、 确定 差 异蛋白 、 通 过Western-Blot、 RT-PCR对部分差异蛋白质进行鉴定并与血清中的差异蛋白ELISA检测结果互相验证， 表达趋势一致且在正常值范围之外的差异蛋白可以用作肾阳虚证动物模型鉴定的生物标志物。 本发明有助于为动物实验中肾阳虚证型提供鉴别指标， 为进一步发现肾阳虚生物标志物提供了基础。权利要求书1页 说明书12页序列表2页 附图6页CN 106645746 A2017.05.10CN 106645746 A1.一种肾阳虚证动物模型生物标志物的筛选及确定方法， 其特征在于， 所需具体步骤如下：（1） 肾阳虚证大鼠模型的建立；（2） 差异蛋白的筛选；（3） 对部分与肾阳虚证相关差异蛋白的验证；（4） 肾阳虚证动物模型生物标志物的确定。2.根据权利要求1所述的一种肾阳虚证动物模型生物标志物的筛选及确定方法， 其特征在于， 所用于构建动物模型的大鼠为WISTAR大鼠。3.根据权利要求1所述的一种肾阳虚证动物模型生物标志物的筛选及确定方法， 其特征在于， 所述差异蛋白筛选的具体步骤如下：(1)大鼠松质骨总蛋白的提取；(2)测定蛋白浓度；(3)双向凝胶电泳分析；(4)凝胶蛋白点的检测与差异蛋白点显示分析；(5)差异蛋白的MALDI-TOF-MS质谱分析；(6)蛋白质数据库检索及鉴定， 确定差异蛋白。4.根据权利要求1所述的一种肾阳虚证动物模型生物标志物的筛选及确定方法， 其特征在于， 所述部分差异蛋白的验证方法如下：(1)应用Western-Blot方法从蛋白质水平对标志物进行验证；(2)应用RT-PCR方法从基因水平对标志物进行验证。5.根据权利要求1所述的一种肾阳虚证动物模型生物标志物的筛选及确定方法， 其特征在于， 所述肾阳虚证动物模型生物标志物的确定方法为： 将血清蛋白的ELISA检测结果与Western-Blot、 RT-PCR检测结果对比分析， 选取表达趋势一致且在正常值范围之外的差异蛋白作为生物标志物。6.利用权利要求5所述的一种肾阳虚证动物模型生物标志物的筛选及确定方法获得的用作肾阳虚证标志物为 型胶原 -1链 （Colla1） 及GDP解离抑制因子1 （Arhgdia） 。权利要求书1/1 页2CN 106645746 A2一种肾阳虚证动物模型生物标志物的筛选及确定方法技术领域0001本发明属于基础研究领域， 具体涉及一种肾阳虚证动物模型生物标志物的筛选及确定方法。背景技术0002“证” 是中医学理论体系的核心， 中医临床首重辨证论治， 但辨证很大程度上受医家自身 （如对中医药知识的理解、 临床经验等） 及患者主观因素的影响， 难以客观化和定量化， 造成辨证结果不统一， 影响治法的确立、 选方用药及临床疗效的评价， 阻碍中医学的研究及发展。 中医基础研究中采用动物模型可以模拟疾病的真实过程， 与 “证” 的生理和病理状态相似， 因此借助肾阳虚证动物模型是研究肾虚证实质的必由之路。0003本实验采用氢化可的松肌肉注射所模拟出的肾阳虚证模型大鼠的症状、 体征和血清cAMP、 cGMP含量检测及cAMP/cGMP比值结果符合目前常用的肾阳虚证模型的鉴定要求， 表明本研究的肾阳虚模型制作是成功的， 但以上评价方法以主观评价为主， 评价指标缺乏特异性、 客观性， 研究结果能否科学阐明中医 “证” 的实质以及所复制的动物证候模型是否具有代表性， 同样涉及辨证的客观化和定量化的问题。 因此寻找具有一定特异性的客观指标来判别鉴定肾阳虚模型是否成功， 是进行后续相关实验的关键。0004基于中医 “肾主骨” 的理论， 骨组织作为 “肾” 功能的外在表现部位之一， 其内在生物学特征的变化与 “肾” 的功能状态必然存在着密切联系。 蛋白质是体现组织细胞功能与执行生命活动最直接的活性物质， 骨组织的结构与功能状态最终体现于其内在功能蛋白质组和基因组的表达状态。 随着对疾病中医 “证” 与蛋白质组相关研究的深入， 目前已经认识到：中医 “证” 的表现实质是疾病个体特定的功能蛋白质组及其基因组的表达水平； 疾病不同中医证型之间区别的实质是功能蛋白质组及其基因组表达水平的差异。 因此， 通过对骨组织差异蛋白质组表达水平的检测， 有望从骨组织功能蛋白质组层面上进一步揭示中医肾阳虚证候的实质。0005基于以上理论基础与研究背景， 本研究借助于蛋白质组学研究思路和技术上的优势， 以大鼠的骨组织 （松质骨） 为研究对象， 分别展示它们在肾阳虚与正常状态下松质骨的蛋白质组图谱， 比较它们之间存在的差异表达蛋白质， 从松质骨功能蛋白质组层面深入探讨中医肾阳虚证的实质， 进一步深化对中医 “肾” 与骨内在关联的认识。 同时， 这些差异表达的蛋白质可能在肾阳虚证发生发展过程中发挥重要作用， 可能是肾阳虚证诊断的潜在生物标志物。 由于生物标记物的发现是冗长而又繁杂的过程， 需借助多种实验技术， 从多层面多角度反复鉴定、 验证及确认。 故对于初步筛选的差异蛋白， 我们需要从蛋白水平、 基因水平进一步对靶定蛋白进行验证， 以规避单一实验方法的局限， 保证前期蛋白质组学检验结果的准确性。 如何选取感兴趣的候选蛋白， 对其进一步研究， 探讨其与肾阳虚证的密切联系，并同时证明本生物标志物筛选方法的可行性是本研究的重点。0006当今科技正步入云媒体、 大数据的时代， 各种信息蜂拥而至， 经云计算、 大数据挖掘， 一些功能强大、 内容丰富、 更新频繁的在线蛋白质相互作用数据库(PPI Database)应运说明书1/12 页3CN 106645746 A3而生， 已成为研究预测蛋白质功能重要手段之一。 本部分研究利用免费在线PPI Database String10对前期所鉴定出已知蛋白进行系统综合分析， 筛选候选蛋白作进一步研究。 该数据库覆盖面广、 整合度高、 更新频率快， 并能对蛋白质之间直接和间接相互作用的关系能做出一定的预测， 从而可初步在生物信息学层面对所鉴定的差异蛋白在疾病中的作用进行预测， 为对后续的验证性研究提供思路。 借助于String数据库检索提供的生物学信息提示， 同时我们查阅相关文献结合前期研究结果， 我们推测肾阳虚证症状和体征的改变可能与某几个关键差异蛋白所在蛋白调控网络的调控密切相关。 因此我们挑选了 型胶原 -1链和GDP解离抑制因子1作为验证对象。0007此外， 在基础实验中， 动物模型的骨骼标本不易获取， 相对而言血标本获取较为便捷且容易保存。 血液检测已是临床上预防和诊治疾病最普遍的辅助手段之一。 血液几乎涵盖来自机体各器官组织的蛋白， 既然在肾阳虚与正常大鼠骨组织 （松质骨） 之间存在差异蛋白质， 那么在血液中是否也存在这种差异。 鉴于此， 我们还试图抽取两组实验大鼠血液测定相应蛋白质的含量， 并分析其浓度与骨组织 （松质骨） 相应蛋白表达水平的一致性， 参照临床上的 “医学参考值范围” 的定义： 将肾阳虚大鼠模型的ELISA测定结果与正常组大鼠的数值进行比较， 观察测定值是否超出了正常大鼠相应指标的波动范围， 我们选用正态分布资料双侧95%参考值范围的公式 （1.96S） 计算出正常组大鼠血清中相应蛋白含量的波动范围， 作为判别测定结果的重要参考， 探寻肾阳虚证诊断的潜在血液标志物。0008基于以上所述， 本研究以大鼠的骨组织 （松质骨） 为研究对象， 在前期蛋白质组学实验基础上， 选取在肾阳虚证发生发展过程中可能起到重要作用的差异蛋白质， 使用Western-Blot和RT-PCR技术从蛋白及基因水平进行双重验证， 进一步明确肾阳虚证的骨组织 （松质骨） 差异蛋白质。 同时， 采用ELISA测定相应蛋白在肾阳虚证与正常大鼠的血液中含量， 为基础实验中肾阳虚证模型的评价奠定研究基础。发明内容0009本发明的目的是为克服目前肾阳虚证辨证技术未客观化的不足， 应用双向凝胶电泳 （2DE） 及MALDI-TOF/MS技术， 获取肾阳虚证及正常组大鼠骨组织蛋白图谱， 经质谱分析及鉴定， 筛选出松质骨中存在差异表达的蛋白， 并且选取可能在肾阳虚证发生发展过程中发挥重要作用的部分蛋白进行Western-Blot和RT-PCR技术从蛋白及基因水平双重验证， 并结合血清中相关蛋白的ELISA检测， 最终靶定可以成为肾阳虚证动物模型的潜在生物标志物。0010为实现上述目的， 本发明采用如下技术方案：一种肾阳虚证动物模型生物标志物的筛选及方法， 其具体步骤如下：（1） 肾阳虚证大鼠模型的建立； 用于构建动物模型的大鼠为WISTAR大鼠。0011（2） 差异蛋白的筛选。 具体包括如下步骤：a)大鼠松质骨总蛋白的提取；b)测定蛋白浓度；c)双向凝胶电泳分析；d)凝胶蛋白点的检测与差异蛋白点显示分析；e)差异蛋白的MALDI-TOF-MS质谱分析；f)蛋白质数据库检索及鉴定， 确定差异蛋白。说明书2/12 页4CN 106645746 A40012（3） 部分差异蛋白的验证。 具体采用以下两种方法进行差异蛋白的验证：a)应用Western-Blot方法从蛋白质水平对标志物进行验证；b)应用RT-PCR方法从基因水平对标志物进行验证。0013（4） 肾阳虚证动物模型生物标志物的确定。 其确定方法为： 将血清蛋白的ELISA检测结果与Western-Blot、 RT-PCR检测对比分析， 选取表达趋势一致且在正常值范围之外的差异蛋白作为生物标志物。0014较之现有技术而言， 本发明的优点在于：（1） 根据中医 “肾主骨” 理论， 以肾阳虚证状态下骨组织作为研究对象， 采用蛋白组学等先进研究方法， 深化了对 “肾主骨” 理论的科学认识。0015（2） 本发明建立在完整的蛋白组学方法基础之上， 经过反复验证和筛选， 挑选出的待测蛋白能反应肾阳虚证的病理本质。0016（3） 血液涵盖了几乎来自全身机体组织的蛋白质， 因此血液检测是临床上最普遍的辅助诊疗手段之一； 而ELISA技术可直接用于检测体液中大分子抗原和特异性抗体等， 具有快速、 灵敏、 简便、 载体易于标准化等优点。 本发明将二者有机结合， 筛选出的肾阳虚证的标志蛋白， 可应用ELISA方法检测其在血液中含量， 并运用正态分布资料双侧95%参考值范围的公式 （1.96S） 计算出正常组大鼠血清中相应蛋白含量的波动范围， 作为判别测定结果的重要参考， 因此可十分简便高效地对实验动物肾阳虚的状态进行判断， 筛选符合需求的动物模型。0017（4） 本发明可以进一步推动中医诊断的便捷、 客观化， 促进基础实验中动物模型的科学评定。附图说明0018图1正常组-肾阳虚组大鼠股骨干松质骨差异蛋白点标识。0019图2 GDP解离抑制因子1 （Arhgdia） 的MAIDI-TOF-TOF/MS质谱图。0020图3 型胶原 -1链 （Col1a1） 的MAIDI-TOF-TOF/MS质谱图。0021图4正常组-肾阳虚组大鼠松质骨中Col1a1和Arhgdia 蛋白表达的比较。0022图5正常组-肾阳虚组大鼠松质骨中Col1a1 mRNA