【发明专利】一种生物活性肽和体外扩增CIK细胞的方法 CN106676068A.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710125422.5(22)申请日 2017.03.04(71)申请人 南京九寿堂医药科技有限公司地址 210008 江苏省南京市栖霞区仙林街道仙林大学城纬地路9号F7栋322室(72)发明人 郭守河其他发明人请求不公开姓名(51)Int.Cl.C12N 5/0783(2010.01)C12P 21/06(2006.01)C07K 1/34(2006.01)A61K 35/17(2015.01)A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称一种生物活性肽和体外扩增CIK细胞的方法(57)摘要本发明公开了一种生物活性肽和体外扩增CIK细胞的方法， 方法包括： 抽取外周静脉血分离单个核细胞， 置于预先包被生物活性肽和抗CD3单克隆抗体的培养瓶中用无血清培养基培养， 以后培养体系中只加入IL-2和无血清培养基， 在37、 5CO2条件下培养14-21天； 其中， 所述生物活性肽以知了猴为原料， 用胰蛋白酶酶解后用超滤膜截留分子量3000-1000u的组分， 冻干即得。本发明提供的生物活性肽可以高效诱导CIK细胞体外扩增， 存活率高， 纯度高， 本发明体外扩增CIK细胞方法得到的CIK细胞具有出色的体外杀瘤效果和体内抑瘤效果； 同时， 本发明方法使用廉价易得的生物活性肽替代了传统培养方法中的重组人IFN-和IL-1， 成本低。权利要求书1页 说明书6页 附图2页CN 106676068 A2017.05.17CN 106676068 A1.一种体外扩增CIK细胞的方法， 抽取外周静脉血分离单个核细胞， 用无血清培养基制成细胞悬液， 置于预先包被有抗人CD3单克隆抗体的培养瓶中培养， 以后培养体系中只补充IL-2和无血清培养基， 在37、 5CO2条件下培养14-21天， 其特征在于： 包被抗人CD3单克隆抗体时还同时包被有生物活性肽， 所述生物活性肽以知了猴为原料， 用胰蛋白酶酶解后用超滤膜截留分子量3000-1000u的组分， 冻干即得。2.根据权利要求1所述的体外扩增CIK细胞的方法， 其特征在于： 生物活性肽和抗人CD3单克隆抗体在培养瓶中的包被浓度分别为20 g/mL和5 g/mL， 预先24小时包被。3.根据权利要求1所述的体外扩增CIK细胞的方法， 其特征在于： 细胞悬液置于培养瓶中开始培养24小时后， 向培养体系中添加1000U/mL的IL-2继续培养， 以后培养体系中只补充IL-2和无血清培养基。4.根据权利要求1所述的体外扩增CIK细胞的方法， 其特征在于， 所述生物活性肽的具体制备方法包括如下步骤：将知了猴洗净后绞成肉糜， 置于超纯水中， 加入胰蛋白酶酶解， 酶解条件为： pH值， 7.8-8.2； 酶解温度， 43-47； 酶解时间， 10-12小时；酶解结束后， 加热使胰蛋白酶灭活， 冷却至常温；冷却后， 8000-10000rpm离心20-30分钟， 取上清， 冷冻干燥得冻干粉；将冻干粉用超纯水溶解， 依次用截留分子量分别为10000u、 5000u、 3000u以及1000u的超滤膜对所得到的生物活性肽进行分离， 收集截留分子量3000-1000u的组分， 冻干即得。5.根据权利要求4所述的体外扩增CIK细胞的方法， 其特征在于， 加热使胰蛋白酶灭活的方法为： 在80-90条件下水浴8-12分钟。6.根据权利要求4所述的体外扩增CIK细胞的方法， 其特征在于， 酶解条件为： pH值，8.0； 酶解温度， 45； 酶解时间， 11小时。7.根据权利要求4所述的体外扩增CIK细胞的方法， 其特征在于， 离心条件为： 9000rpm离心25分钟。8.根据权利要求4所述的体外扩增CIK细胞的方法， 其特征在于： 所述胰蛋白酶的添加量为底物肉糜重量的0.2-0.3。9.权利要求1-8任一方法制备的CIK细胞。10.权利要求9所述的CIK细胞用于制备治疗肺癌的药物的用途。权利要求书1/1 页2CN 106676068 A2一种生物活性肽和体外扩增CIK细胞的方法技术领域0001本发明属于医药领域， 涉及多肽药物的制备和应用， 具体涉及一种生物活性肽和体外扩增CIK细胞的方法。背景技术0002肺癌是全球最常见的恶性肿瘤， 死亡率居恶性肿瘤之首。 我国肺癌发病率呈现逐年上升趋势， 年平均增长近2。 肺癌根据病理学特点的不同分为多种组织类型， 肺癌组织类型不同， 其治疗措施也不同。 根据2004版WHO分类， 常见肺癌组织病理学分型分为非小细胞癌(NSCLC)和小细胞癌(SCLC)。 非小细胞癌又分为鳞状细胞癌(SCC)、 腺癌(AC)和大细胞癌(LCC)。 不同肺癌临床治疗方案不同， 预后效果也不同。 因此， 为了提高治疗效果， 肺癌的治疗策略已经从传统的以分期为基础的治疗模式转变为以组织学类型和基因突变为指导的个体化、 精准的多学科治疗模式。 个体化治疗提高了肺癌的治疗和预后效果。0003生物活性肽(Biologically active peptides,BAP)是一种具有特殊生理功能的小分子活性物质， 如抗肿瘤、 抗菌、 抗高血压、 抗病毒以及提高免疫力等， 这些物质广泛存在于动物、 植物以及微生物中。 生物活性肽主要有4种来源， 分别为蛋白生物活性肽、 微生物发酵代谢多肽、 天然活性多肽以及化学合成多肽。 知了猴又称知了龟、 爬蚱等， 是金蝉的成熟若虫， 蛋白含量非常高， 具有较高的食用和药用价值。 申请人对知了猴生物活性肽进行了大量研究， 已经发现不同工艺制备的基于知了猴的生物活性肽明显抑制肺腺癌A549细胞株增殖(申请号201710109721X)和抑制小细胞肺癌干细胞侵袭和转移(申请号2017101067746)的作用。0004肿瘤免疫治疗是肿瘤生物治疗中的主要方法， 而过继免疫治疗是肿瘤免疫治疗的一种有效方法。 细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-inducedkiller,CIK)兼有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和自然杀伤(natural killer,NK)细胞非主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)限制性杀瘤的优点。 它可以在不损伤机体免疫系统结构和功能的前提下， 直接杀伤肿瘤细胞， 并调节和增强机体免疫功能， 在治疗恶性实体肿瘤中所取得的效果已得到广泛的认同。 而获取数量足够且生物活性强的CIK细胞是取得良好疗效的基础。0005传统培养CIK细胞方法需要较高的基础细胞数， 需用血细胞分离机分离外周血、 提取单个核细胞， 繁琐耗时， 污染机会大， 特别不适宜异体供血。 如何简化培养过程， 提高CIK细胞在体外增殖效率和细胞毒活性是基础研究的一个热点问题， 该问题的有效解决可以提高过继免疫治疗在肿瘤免疫治疗领域的应用。0006目前尚未有研究证明知了猴生物活性肽可以提高CIK细胞体外增殖效率和细胞毒活性。发明内容0007本发明的目的在于提供一种生物活性肽和体外扩增CIK细胞的方法。说明书1/6 页3CN 106676068 A30008上述目的是通过如下技术方案实现的：0009一种体外扩增CIK细胞的方法， 抽取外周静脉血分离单个核细胞， 用无血清培养基制成细胞悬液， 置于预先包被有抗人CD3单克隆抗体的培养瓶中培养， 以后培养体系中只补充IL-2和无血清培养基， 在37、 5CO2条件下培养14-21天， 其中： 包被抗人CD3单克隆抗体时还同时包被有生物活性肽， 所述生物活性肽以知了猴为原料， 用胰蛋白酶酶解后用超滤膜截留分子量3000-1000u的组分， 冻干即得。0010优选地， 生物活性肽和抗人CD3单克隆抗体在培养瓶中的包被浓度分别为20 g/mL和5 g/mL， 预先24小时包被。0011优选地， 细胞悬液置于培养瓶中开始培养24小时后， 向培养体系中添加1000U/mL的IL-2继续培养， 以后培养体系中只补充IL-2和无血清培养基。0012优选地， 所述生物活性肽的具体制备方法包括如下步骤：0013将知了猴洗净后绞成肉糜， 置于超纯水中， 加入胰蛋白酶酶解， 酶解条件为： pH值，7.8-8.2； 酶解温度， 43-47； 酶解时间， 10-12小时；0014酶解结束后， 加热使胰蛋白酶灭活， 冷却至常温；0015冷却后， 8000-10000rpm离心20-30分钟， 取上清， 冷冻干燥得冻干粉；0016将冻干粉用超纯水溶解， 依次用截留分子量分别为10000u、 5000u、 3000u以及1000u的超滤膜对所得到的生物活性肽进行分离， 收集截留分子量3000-1000u的组分， 冻干即得。0017优选地， 加热使胰蛋白酶灭活的方法为： 在80-90条件下水浴8-12分钟。0018优选地， 酶解条件为： pH值， 8.0； 酶解温度， 45； 酶解时间， 11小时。0019优选地， 离心条件为： 9000rpm离心25分钟。0020优选地， 所述胰蛋白酶的添加量为底物肉糜重量的0.2-0.3。0021上述方法制备的CIK细胞。0022上述CIK细胞用于制备治疗肺癌的药物的用途。0023本发明的有益效果：0024本发明提供的生物活性肽可以高效诱导CIK细胞体外扩增， 存活率高， 纯度高， 本发明体外扩增CIK细胞方法得到的CIK细胞具有出色的体外杀瘤效果和体内抑瘤效果； 同时， 本发明方法使用廉价易得的生物活性肽替代了传统培养方法中的重组人IFN-和IL-1 ， 成本低。附图说明0025图1为两种培养方法诱导的CIK细胞的增殖能力；0026图2为生物活性肽诱导培养法第21天CD3+CD56+CD16+亚群细胞比例流式图；0027图3为两种培养方法诱导的CIK细胞体内抑瘤率。具体实施方式0028下面结合具体实施例和附图详细介绍本发明的技术方案和技术效果。 未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件， 例如教科书和实验指南中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件， 为本领域普通技术人员熟知或易于获知。说明书2/6 页4CN 106676068 A40029实施例1生物活性肽的制备0030一、 实验材料00311、 仪器试剂0032超滤杯和超滤膜购于上海摩速科学器材有限公司；0033胰蛋白酶(1:250U/mg)购于广州市齐云生物技术有限公司。00342、 实验样品0035收集刚出土上树的新鲜知了猴， 保存在水中， 于-20冻存。 使用前于室温条件自然化冻。0036二、 实验方法和结果00371、 酶解方法0038将知了猴洗净后绞成肉糜， 取10g肉糜置于50mL超纯水中， 加入胰蛋白酶进行酶解， 胰蛋白酶的添加量为底物肉糜重量的0.25， 酶解条件为： pH值， 8.0； 酶解温度， 45；酶解时间， 11小时；0039酶解结束后， 在85条件下水浴10分钟使胰蛋白酶灭活， 冷却至常温；0040冷却后， 9000rpm离心25分钟， 取上清， 冷冻干燥得冻干粉。00412、 纯化方法0042将冻干粉用超纯水溶解(1g冻干粉加10mL超纯水)， 然后依次用截留分子量为10000u、 5000u、 3000u以及1000u的超滤膜对所得到的生物活性肽进行分离， 收集截留分子量3000-1000u的组分， 冷冻干燥(含水量5)即得。0043超滤过程中控制CO2的压力使其小于0.25MPa。0044实施例2 CIK细胞的体外培养、 扩增、 存活率测定及免疫表型检测0045一、 实验方法00461、 CIK细胞的体外培养、 扩增和存活率测定0047抽取30例健康人外周静脉血共计150mL， 用淋巴细胞分离液提取外周血单个核细胞， PBS洗涤后用KBM551无血清培养基制成细胞悬液， 调整细胞浓度为1105/mL， 均分为6份， 分别用本发明生物活性肽诱导培养法和传统诱导培养法培养， 每种方法平行操作3份。0048生物活性肽诱导培养法： 培养24小时前， 用含有20 g/mL生物活性肽和5