DB53_T 1057-2021 滇金丝猴肠道微生物组数据获取技术规程.pdf

ICS 11.220CCS B 4153云南省地方标准DB53/T 10572021滇金丝猴肠道微生物组数据获取技术规程Regulation for data acquisition of gut microbiota for Rhinopithecus bieti2021 - 09 - 30 发布2021 - 10 - 14 实施云南省市场监督管理局发 布学兔兔 w w w .b z f x w .c o m 标准下载DB53/T 10572021I目次前言.III1范围.12规范性引用文件.13术语和定义.14基本要求.24.1实验室通用要求.24.2主要试剂及仪器设备.25样品采集和保存.26滇金丝猴肠道微生物总 DNA 提取及检测. 26.1试剂盒选取.26.2肠道微生物总 DNA 提取.26.3肠道微生物总 DNA 质量检测.27肠道微生物组高通量测序.27.1肠道微生物 16SrRNA 基因引物选取及扩增.27.2肠道微生物 16SrRNAPCR 扩增产物电泳检测及纯化.37.3肠道微生物 16SrRNA 基因测序.37.4肠道微生物宏基因组测序.38肠道微生物组数据获取.38.116SrRNA 基因数据质控.38.2宏基因组数据质控.38.3宏基因组数据去除宿主信息.38.4肠道微生物组数据获取.3附录 A（规范性）主要试剂及仪器设备. 4附录 B（规范性）粪便样品的采集和保存方法. 5附录 C（规范性）总 DNA 样品的提取步骤、琼脂糖凝胶电泳检测及成像方法.8附录 D（规范性）16SrRNAPCR 引物、反应体系、反应时间及产物纯化步骤.9学兔兔 w w w .b z f x w .c o m 标准下载学兔兔 w w w .b z f x w .c o m 标准下载DB53/T 10572021III前言本文件按照GB/T 1.1-2020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由云南省林业与草原局、云南省市场监督管理局共同提出。本文件由云南省林业标准化技术委员会（YNTC02）归口。本文件主要起草单位：云南大学、云南省标准化研究院。本文件主要起草人：于黎、黄艳梅、张志刚、朱勋程、李依恬、李宁、刘纯兵、徐志茹、姚雪沁、胡靖扬、吴宏、匡卫民。学兔兔 w w w .b z f x w .c o m 标准下载学兔兔 w w w .b z f x w .c o m 标准下载DB53/T 105720211滇金丝猴肠道微生物组数据获取技术规程1范围本文件规定了滇金丝猴 （Rhinopithecus bieti） 肠道微生物组数据获取的基本要求、 样品采集和保存、肠道微生物总DNA提取及检测、肠道微生物组高通量测序、肠道微生物组数据获取。本文件适用于野外及圈养滇金丝猴微生物组数据获取。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 19489 实验室 生物安全通用要求3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1肠道微生物 gut microbiota动物肠道中存在的数量庞大的微生物，并帮助宿主完成多种生理生化功能的微生物群落。3.2肠道微生物总 DNAgut microbiota total DNA肠道内所有微生物DNA和部分宿主DNA的总和。3.3宏基因组 metagenome特定环境下所有生物的遗传物质的总和，其中包括了样品中所有微生物的遗传信息。3.416S 核糖体 RNA （16S rRNA）细菌染色体上编码核糖体RNA亚基的一个基因，存在于所有细菌的基因组中。3.516S 核糖体 RNA V3-V4 区 （16S rRNA V3-V4）16S rRNA基因序列中高度变化的区域。3.6聚合酶链式反应 polymerase chain reaction，PCR以一对寡核苷酸引物、四种脱氧核糖核苷酸(dNTPs)为原料，在合适的温度、离子条件和耐热DNA聚合酶催化下，在体外人工合成特异的DNA片段的过程。3.7基因组测序 genome sequencing对生物体的基因组序列进行测定，以获得基因组信息。学兔兔 w w w .b z f x w .c o m 标准下载DB53/T 1057202123.8高通量测序 high-throughput sequencing能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定的技术。3.9读长 reads高通量测序平台产生的序列读长称为reads，即测序读到的碱基序列片段，是测序的最小单位。3.10宿主 host给微生物提供营养和场所的生物，本标准中指滇金丝猴。4基本要求4.1实验室通用要求实验室应满足GB 19489中生物安全实验室的要求。4.2主要试剂及仪器设备主要试剂及仪器设备见附录A。5样品采集和保存肠道微生物从滇金丝猴粪便样品中获取，粪便样品的采集和保存方法见附录B。6滇金丝猴肠道微生物总 DNA 提取及检测6.1试剂盒选取选取滇金丝猴粪便样品中提取肠道微生物总DNA，有多种商用试剂盒可供选择。6.2肠道微生物总 DNA 提取参照商用试剂盒说明书进行总DNA提取，提取步骤见附录C。6.3肠道微生物总 DNA 质量检测使用微量分光光度计和1%琼脂糖凝胶电泳进行DNA浓度检测。粪便样品提取的总DNA 260/280在1.72.1之间，浓度超过2 ng/L，总量超过0.25 g的DNA样品为合格。琼脂糖凝胶电泳检测及成像方法见附录C。7肠道微生物组高通量测序7.1肠道微生物 16S rRNA 基因引物选取及扩增16S rRNA基因引物选择V3-V4区的引物338F及806R。扩增区域为16S rRNA基因V3-V4区。引物序列及反应条件见附录D。7.2肠道微生物 16S rRNA PCR 扩增产物电泳检测及纯化学兔兔 w w w .b z f x w .c o m 标准下载DB53/T 1057202137.2.1PCR 扩增完成后，取 PCR 产物 3 L，经 2%琼脂糖凝胶电泳检测，如电泳条带清楚、片段大小正确，表明 PCR 扩增成功。不符合质量要求的产物，可重新进行 PCR 扩增。每个样本进行 3 个 PCR 重复，需将 3 个重复的 PCR 产物混合，以达到测序量。7.2.2PCR 产物纯化，流程参照商用试剂盒纯化流程。纯化步骤见附录 D。7.3肠道微生物 16S rRNA 基因测序16S rRNA基因测序使用高通量测序平台进行。根据所使用的建库试剂盒构建文库。根据高通量测序试剂盒和测序仪操作说明完成试剂装载，设置测序参数进行测序。7.4肠道微生物宏基因组测序宏基因组测序可使用高通量测序平台进行。 根据所使用的建库试剂盒构建文库。 根据高通量测序试剂盒和测序仪操作说明完成试剂装载，设置测序参数进行测序。8肠道微生物组数据获取8.116S rRNA 基因数据质控16S rRNA基因测序数据，通过生物信息学软件进行质控，获取16S rRNA基因数据。质控去除双端引物序列和基因条形码序列， 过滤拼接后序列长度小于400 bp的序列， 可使用QIIME2软件 “quality-filter”默认设置进行初始质量筛选，“Deblur”去除低丰度序列以及剪切序列末端，统一获得前400 bp区段的高质量序列，获得滇金丝猴肠道微生物16S rRNA基因数据。8.2宏基因组数据质控宏基因组测序数据， 通过生物信息学软件进行质控。 宏基因组数据质控标准为碱基平均质量阈值高于20，最短reads长度大于50 bp。8.3宏基因组数据去除宿主信息使用滇金丝猴全基因组数据作为参考基因组，宏基因组质控数据使用BWA软件的MEM算法默认参数，与滇金丝猴全基因组序列比对，去除比对上的序列，获取滇金丝猴肠道微生物宏基因组数据。8.4肠道微生物组数据获取质控后的16S rRNA基因数据以及质控、去除宿主信息后的宏基因组数据即为滇金丝猴肠道微生物组数据。学兔兔 w w w .b z f x w .c o m 标准下载DB53/T 105720214AA附录A（规范性）主要试剂及仪器设备A.1主要试剂A.1.150TAE缓冲液(TAE Buffer)：Tris碱242 g和57.1 mL冰醋酸，用双蒸水定容到1 L。A.1.2GeneFinder核酸染料，用于凝胶成像显示条带。A.1.36上样缓冲液（Loading Buffer） ，含有溴酚蓝，用于电泳和凝胶成像。A.1.42.5 mM dNTP试剂：dATP、dCTP、dGTP和dTTP的预混溶液。A.1.55PCR Buffer。A.1.6FastPfu 酶。A.1.7无菌水：ddH2O。A.1.8琼脂糖。A.1.91%琼脂糖凝胶：用于DNA质量检测。1 g琼脂糖与100 mL 1TAE缓冲液，加热融化均匀，60 时，倒入胶槽，插上样品梳。室温下待凝胶凝固后，垂直向上拔出固定在凝胶中的样品梳。A.1.102%琼脂糖凝胶：用于PCR产物检测。2 g琼脂糖与100 mL 1TAE缓冲液，加热融化均匀，60 时，倒入胶槽，插上样品梳。室温下待凝胶凝固后，垂直向上拔出固定在凝胶中的样品梳。A.1.11牛血清白蛋白（BSA） ：球蛋白，PCR反应过程中起到稳定扩增酶、降低PCR抑制物的作用。A.1.12所使用的试剂盒中的相关试剂。A.2仪器设备A.2.1PCR仪。A.2.2低温高速离心机。A.2.3单道可调移液器（2 L，10 L，200 L，1 000 L） 。A.2.4电子天平（量程0.01 mg10 000 mg） 。A.2.5水浴恒温振荡器。A.2.6普通离心机。A.2.7超纯水器。A.2.8高压灭菌器。A.2.9电泳仪。A.2.10凝胶成像系统。A.2.11磁力搅拌器。A.2.12超低温冰箱（80 ） 。A.2.13低温冰箱（20 ） 。B学兔兔 w w w .b z f x w .c o m 标准下载DB53/T 105720215附录B（规范性）粪便样品的采集和保存方法B.1采样B.1.1基本要求采样时，应符合实验动物的福利和伦理的相关要求。B.1.2采样工具、标本容器标准以及人员要求B.1.2.1圈养滇金丝猴采样工具记录表格、一次性PE手套、封口袋、5 mL塑料样品管、无水乙醇、记号笔、铅笔、标签纸、剪刀、镊子、注射器、酒精棉等。B.1.2.2野外滇金丝猴采样工具在B.1.2.1的基础上，增加北斗定位系统、罗盘、地形图等。B.1.2.3标本容器的标准盛粪便标本的容器应清洁、干燥、有盖，无吸水和渗漏。细菌学检查，粪便标本应采集于灭菌、有盖的容器内。B.1.2.4采样人员要求样本采集人员应是经过专业培训的人员，严格穿戴个人防护装备。B.2粪便新鲜程度判定以滇金丝猴粪便表面的完整程度、 湿度颜色以及气味等条件判断滇金丝猴粪便的新鲜程度。 新鲜的粪便样品表面完整光滑无杂质，微微湿润有光泽感，呈绿色或深绿色。B.3粪便样品的选取原则B.3.1采集滇金丝猴新鲜粪便，同一堆粪便只采集一份样品，两堆样品的距离应大于3 m。B.3.2滇金丝猴母幼粪便样品，应分开采集；依据母猴和幼猴的粪便大小有明显差异作出判断，并在备注栏记录。B.3.3采集3 g5 g新鲜粪便。B.4样品采集方法B.4.1采集粪便内部的样品，并佩戴一次性PE手套。每次采样时应更换新的PE手套，以避免样品间的交叉污染。B.4.2采集时，直接剥取分离新鲜粪便的内部部分，分别放入盛有无水乙醇的样品管中，拧紧盖子后上下用力摆动数次，使样品得到充分湿润，并检查是否有液体渗漏。贴上样品标签纸，标识样品编号和坐标，将样品管放入自封袋，并再次写上样品编号，以避免无水乙醇漏出导致编号丢失。B.5样品记录与编号学兔兔 w w w .b z f x w .c o m 标准下载DB53/T 105720216在采集粪便样品时，应填写滇金丝