DB35∕T 1929-2020 鸭瘟抗体间接ELISA试剂盒检测技术规范.pdf

ICS 11.220 B 41 DB35 福建省地方标准 DB35/T 19292020 鸭瘟抗体间接 ELISA 试剂盒检测技术规范 Detection technical specification of indirect ELISA test kit for duck plague antibody 2020 - 09 - 29 发布 2020 - 12 - 29 实施 福建省市场监督管理局 发 布 DB35/T 19292020 I 目 次 前言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 疫病简述 . 1 4 原理 . 1 5 主要仪器 . 1 6 主要试剂 . 1 7 试剂盒的组成、组装和保存 . 2 8 试剂盒的要求 . 3 9 样品的采集、保存与运输 . 4 10 试剂盒操作步骤 . 4 11 结果判定 . 5 附录 A（规范性附录） 相关试剂的配制. 6 参考文献 . 8 库七七 w w w .k q q w .c o m 标准下载DB35/T 19292020 II 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。 本标准由福建省农业科学院提出。 本标准由福建省农业农村厅归口。 本标准起草单位：福建省农业科学院畜牧兽医研究所、福建省动物疫病预防控制中心、福州市动物疫病预防控制中心。 本标准主要起草人：陈珍、傅光华、刘道泉、刘荣昌、黄瑜、史惠、吴波平、陈翠腾、陈冬群、陈秀明、施少华、朱春华、刘斌琼、蔡国漳。库七七 w w w .k q q w .c o m 标准下载DB35/T 19292020 1 鸭瘟抗体间接 ELISA 试剂盒检测技术规范 1 范围 本标准规定了鸭瘟抗体间接ELISA检测试剂盒的检测技术规范。 本标准适用于鸭血清中鸭瘟抗体的定性检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 66822008 分析实验室用水规格和试验方法 3 疫病简述 鸭瘟（duck plague，DP）又称为鸭病毒性肠炎，俗称“大头瘟”，是由鸭瘟病毒引起的一种急性、高度致死性传染病，不同日龄的鸭均易感染。特征病变为食道、小肠和泄殖腔粘膜出血、坏死、溃疡，病程稍长者食道和泄殖腔粘膜表面形成黄白色伪膜。该病传播迅速、发病率和死亡率高，广泛流行于我国华南、华中和华东地区。 4 原理 本标准是针对鸭瘟抗体间接ELISA试剂盒建立的检测技术规范。工作原理为：当鸭血清中鸭瘟抗体阳性时，在间接ELISA抗体反应过程中，鸭血清中的鸭瘟抗体先与包被的纯化鸭瘟病毒结合，形成抗原抗体复合物，随后与辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鸭IgG相结合，加入显色剂显色，置450 nm波长下测定光密度值（OD450），通过分析其P/N值判定鸭血清中鸭瘟病毒抗体的水平。 5 主要仪器 所使用的主要仪器如下： a) 酶标仪（具有 450 nm 波长滤光片）。 b) 37 1 恒温箱。 c) 96 孔酶标板。 d) 振荡器。 e) 可调微量移液器：包括多道（10 L、100 L、300 L）和单道等。 6 主要试剂 所使用的主要试剂如下： 库七七 w w w .k q q w .c o m 标准下载DB35/T 19292020 2 a) 包被抗原：按照附录 A 中 A.1 配制。 b) 标准阳性血清：按照附录 A 中 A.2 配制。 c) 标准阴性血清：按照附录 A 中 A.3 配制。 d) 参考品：阳性参考品（通过中和试验和本试剂盒检测均为阳性）20 份，阴性参考品（通过中和试验和本试剂盒检测均为阴性）20 份，每份参考品分装为每支 15 L 装于无菌离心管中，做好标记，置于-70 5 保存备用。 e) 酶标二抗：HRP 标记的羊抗鸭 IgG。 f) TMB 显色液：TMB 含量为 200 g/mL。 g) 碳酸盐缓冲液：按照附录 A 中的 A.4 配制。 h) 20PBS 溶液：按照附录 A 中的 A.5 配制。 i) 稀释液：按照附录 A 中的 A.6 配制。 j) 洗涤液：按照附录 A 中的 A.7 配制。 k) 终止液：按照附录 A 中的 A.8 配制。 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂，实验用水应符合GB/T 66822008中一级水的要求。 7 试剂盒的组成、组装和保存 7.1 试剂盒 A 的组成 7.1.1 标准阴性血清，10 L，清亮、无溶血。 7.1.2 标准阳性血清，10 L，清亮、无溶血。 7.1.3 酶标二抗，10 L，无色透明液体。 7.2 试剂盒 B 的组成 7.2.1 包被好的酶标板，3 块，每个酶标板最大检测待检样品份数为 90 份。 7.2.2 磷酸盐缓冲液（20PBS），100 mL，无色透明。 7.2.3 TMB 显色液，10 mL/瓶3 瓶，无色透明，棕色瓶装，避光保存。 7.2.4 终止液，40 mL，无色透明。 7.2.5 吐温-20，500 L，无色透明。 7.2.6 操作说明书，1 份。 7.3 试剂盒的组装 7.3.1 本试剂盒由试剂盒 A 和试剂盒 B 组成。 7.3.2 试剂盒外包装上应标明产品名称、包装规格、生产单位、生产批号、生产日期、有效期、产品标准编号、注册编号和保存条件。 7.3.3 各组分均应贴上标签（内容包括：组分名称、生产日期、数量、保存条件）。 7.4 试剂盒的保存 试剂盒A于-20 1 条件下保存，试剂盒B于2 8 条件下保存。 库七七 w w w .k q q w .c o m 标准下载DB35/T 19292020 3 8 试剂盒的要求 8.1 物理检查 8.1.1 外观：各组分外包装应完好、品名清晰。 8.1.2 试剂盒：各组分应齐全、完整，液体无渗漏、澄清透明无沉淀。 8.2 阳性参考品的符合率 按试剂盒操作说明书对阳性参考品进行检测，检测结果与阳性参考品的符合率不低于95%。 8.3 阴性参考品的符合率 按试剂盒操作说明书对阴性参考品进行检测，检测结果与阴性参考品的符合率不低于95%。 8.4 最低检测限 按试剂盒操作说明书对不同稀释度的标准阳性血清进行ELISA检测时，最低检测限为1:3 200。 8.5 批内差 按试剂盒操作说明书对阴阳性参考品进行检测， 取10个不同试剂盒平行检测， 计算检测结果的平均值M和标准差SD，根据式（1）计算变异系数CV，CV不宜高于10%。 %100MSDCV. (1) 式中： CV变异系数； SD测量结果的标准差； M 测量结果的平均值。 8.6 批间差 取3个批次的试剂盒（每批次10个），对阴阳性参考品进行检定，计算30次检测结果的平均值M和标准差SD，根据式（1）计算变异系数CV，结果不宜高于10%。 8.7 有效期 试剂盒的有效保存期为12个月。 8.8 稳定性 8.8.1 效期稳定性： 取贮存条件下保存 13 个月的试剂盒， 按8.28.5方法进行检测， 结果应符合 8.28.5 的要求。 8.8.2 稳定性试验： 取贮存条件下保存 3 月、 6 月、 9 月和 12 月的试剂盒， 按 8.28.5 方法进行检测，结果应符合 8.28.5 的要求。 库七七 w w w .k q q w .c o m 标准下载DB35/T 19292020 4 9 样品的采集、保存与运输 9.1 样品采集 采集鸭翅静脉血0.5 mL1.0 mL，37 1 恒温箱静置1 h后转入2 8 条件下静置2 h4 h，析出液体即为待检血清。 9.2 样品保存 置于-20 1 条件下贮存备用，使用前2 h取出解冻，避免血清反复冻融。若分离的血清需当天使用，则放置2 8 条件下备用。 9.3 样品运输 血清样品应在-20 1 条件下运输。 10 试剂盒操作步骤 10.1 试剂均衡 用前TMB显色液、终止液和磷酸盐缓冲液应取出室温均衡30 min。 10.2 试剂配制 从试剂盒B中取出20PBS溶液、吐温-20，按照附录A中A.6和A.7配制1PBS工作液和PBST工作液。 10.3 加样 从试剂盒B中取出酶标板， 试剂盒A中取出标准阴性血清和标准阳性血清。 待检血清标准阴性血清和标准阳性血清用1PBS按1:100倍稀释后加入酶标板中，每孔加入100 L，其中标准阴性血清、标准阳性血清作两个重复孔，另设两个空白对照孔（每孔加入PBS 100 L）。37 l 恒温箱反应l h。 10.4 洗涤 取出酶标板，每孔加入250 L PBST洗涤液置于振荡器上振荡洗涤3次，每次3 min。甩干液体。 10.5 加酶标二抗 从试剂盒B中取出酶标二抗，用PBS作1:3 333倍稀释后（取10 mL PBS溶液加入3 L酶标二抗），酶标板的每孔加入100 L，于37 1 恒温箱反应45 min，取出后洗涤，洗涤方法同10.4。 10.6 显色 洗涤后，每孔加入TMB显色液100 L，37 1 恒温箱避光显色8 minl0 min后取出。 10.7 终止反应 每孔加终止液100 L终止反应，立即读数。 10.8 读数 将酶标板置酶标仪中，以450 nm波长测量反应孔OD450值。 库七七 w w w .k q q w .c o m 标准下载DB35/T 19292020 5 11 结果判定 读出酶标板中各孔的OD450值之后，进行如下判定： a) 以酶标仪在 450 nm 波长下测量样品孔 OD 值（OD450），当阴性血清的 OD450值不超过 0.22、阳性血清的 OD450值不低于 1.0、空白孔 OD450值不超过 0.08 时试验成立。 b) 按照式（2）计算待检血清的t值： CNCSt. (2) 式中： tP/N值； S样品孔OD450值； C空白孔OD450平均值 N标准阴性血清OD450平均值。 c) 待检血清t2.1 判为阳性，t1.9 判为阴性；1.9t2.1 判为可疑，重检后t1.9 可判为阳性。 库七七 w w w .k q q w .c o m 标准下载DB35/T 19292020 6 A A 附 录 A （规范性附录） 相关试剂的配制 A.1 抗原的制备 取DEF细胞培养的鸭瘟病毒液于4 、8 000 r/min离心30 min，上清于4 、45 000 r/min离心2 h，弃上清后沉淀用2 mL灭菌PBS重悬，获病毒浓缩液，-70 5 下保存。抗原的纯化是通过蔗糖梯度离心及超速离心加以浓缩获得，方法如下：制备10%、20%、30%、40%和50%等五个梯度的蔗糖平衡液，在10%蔗糖液上铺病毒浓缩液， 于4 、 40 000 r/min水平离心3 h， 收集30%40%病毒带， 于4 、 45 000 r/min、离心2 h，弃上清后沉淀用灭菌PBS重悬。测定其蛋白浓度，储于-70 5 条件下作为抗原备用。 A.2 标准阳性血清的制备 将鸭瘟病毒浓缩液经甲醛灭活后，经检验灭活合格后与弗氏完全佐剂或不完全佐剂按1:1.2乳化成免疫用的抗原。按制备高免血清的常规方法免疫30日龄SPF麻鸭，首免鸭瘟病毒浓缩抗原乳化液1 mL/只。14 d二免，2 mL/只（分三点注射），二免后28天采血、分离血清，血清中和效价1:128，即作为鸭瘟病毒标准阳性血清。 A.3 标准阴性血清的制备 购进SPF麻鸭胚，孵化至鸭苗出壳后于隔离器中饲养，至30日龄时采血、分离血清，无血清中和作用（中和效价1:2）作为鸭瘟病毒标准阴性血清。 A.4 碳酸盐缓冲液 0.05 mol/L碳酸盐缓冲液（pH9.6） NaHCO3 1.46 g Na2CO3 0.97 g（或Na2CO312H2O 1.2 g） 去离子水或蒸馏水 500 mL A.5 20PBS溶液（pH7.4） NaCl 160.0 g KCl 4.0 g Na2HPO412H2O 58.0 g KH2PO4 4.0 g 将上述试剂溶于800 mL去离子水中，定容至1 000 mL，（1.034105） Pa高压灭菌